鹽脅迫嚴重影響菊花的生長與生產,因此挖掘響應鹽脅迫關鍵基因顯得尤為重要。本研究試驗材料選用菊花‘神馬’(Chrysanthemum moliflium‘Jinba’),選定合適的處理時間和濃度后,對正常培養(yǎng)和鹽脅迫下的菊花根系進行轉錄組測序,篩選重要通路及相關差異表達基因,利用qRT-PCR驗證候選基因的表達,同時,測定鹽脅迫前后菊花根系的離子含量,滲透調節(jié)物質含量,抗氧化酶活性等生理指標的變化。主要研究結論如下:1、分別用100、200、300 mM NaCl處理0、3、6、12、24、36、48 h后,測定菊花葉片電導率、丙二醛含量、葉綠素含量和根系活力的變化。結果表明,在100 mM鹽處理下,各項指標的變化與對照組相差不大;在300 mM鹽處理下,各項指標均表現(xiàn)顯著上升或下降的趨勢;而在200 mM鹽處理下,尤其處理24 h變化顯著,我們推測菊花利用體內的調節(jié)機制適應脅迫環(huán)境,由此確定了24 h和200 mM為轉錄組測序的合適值。2、利用Illumina Hiseq測序平臺對菊花根系進行轉錄組測序,創(chuàng)建了6個cDNA文庫(CK1、CK2、CK3、SS1、SS2、SS3)。共獲得大約68.30 Gb有效序列,經(jīng)從頭組裝得到70,764個unigenes,并與公共數(shù)據(jù)庫TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比對得到基因注釋,幾乎涵蓋了所有的功能和代謝通路。以|log2(fold change)|1且P值≤0.05為篩選標準,鑒定出2117個差異表達基因,包括1347個上調基因和770個下調基因,有大量差異表達基因富集到調控細胞內各種生理生化過程中,為研究菊花根系的耐鹽調控機制提供了豐富的數(shù)據(jù)。3、根據(jù)基因功能注釋、富集結果以及前人研究,篩選了與信號轉導、植物激素、離子轉運、滲透調節(jié)、抗氧化調節(jié)、重要功能蛋白相關的差異表達基因,以及轉錄因子,并從中選取20個差異倍數(shù)較大的基因作為候選基因,利用qRT-PCR測定其在鹽脅迫后0、3、6、12、24、36、48 h的表達模式。不同DEGs的表達模式有差異,暗示這些基因可能通過不同的調控途徑參與菊花根系脅迫響應,也驗證了測序結果的可靠性。4、離子含量測定表明:Ca~(2+)含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;脅迫初期Na~+外流含量降低,K~+內流顯著增大,含量升高,而隨著脅迫時間的增長兩者又受到抑制。5、滲透調節(jié)物質含量測定表明:鹽脅迫下菊花根系各滲透調節(jié)物質積累進程不同,脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,可溶性糖含量始終處于增加狀態(tài),積累較多。6、抗氧化物酶活性測定表明:POD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;SOD活性始終受到抑制;CAT活性在初期受到抑制,而后又被激活。綜上所述,本研究基于轉錄組測序篩選菊花根系響應鹽脅迫的耐鹽基因,并鑒定候選基因,比較其表達模式差異,將基因表達與生理數(shù)據(jù)結合起來,闡述菊花耐鹽機理。
【學位單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S682.11
【部分圖文】：

菊花耐鹽性檢測（A）REC測定；（B）MDA含量測定；（C）葉綠素含量測定；（D）根系活力測定Fig.3-1Salttolerancetestofchrysanthemum(A)DeterminationofREC;(B)DeterminationofMDA;(C)Determinationofchlorophyllcontent;(D)Determinationof

基于轉錄組測序對菊花耐鹽性的研究163.2.2組裝結果統(tǒng)計分析本研究共組裝得到95,476條transcripts和70,764條unigenes，其中unigenes的長度從200bp到1000+bp不等。大多數(shù)unigenes在200和500bp（59.32%）之間，長度超過1000bp的unigenes占10.80%。Transcript的N50為845，unigene的N50為853，組裝完整性較高，具體組裝結果如表3-1、圖3-2所示。表3-2從頭測序組裝統(tǒng)計Table3-2denovotranscriptomeassemblystatisticsAll(>=200bp)>=500bp>=1000bpN50GC(%)TotalLengthMaxLengthMinLengthAverageLengthTranscript95476499471751784543.256886571016890300721Unigene70764356331288585343.385093924516890300719注：N50:將transcript從長到短排序，依次累加transcript堿基數(shù)，當累計堿基數(shù)達到transcript總堿基數(shù)50%時的transcript的長度，unigene采用相同的方法。Note:N50:Rankthetranscriptfromlongtoshort,andthenaccumulatethenumberoftranscriptbases.Whenthecumulativenumberofbasesreaches50%ofthetotalnumberofbasesinthetranscript,unigeneadoptsthesamemethod.圖3-2unigenes長度分布和unigenes、transcript長度分布比對Fig.3-2Unigeneslengthdistributionandunigenes、transcriptlengthdistribution

山東農業(yè)大學碩士學位論文173.2.3Unigene功能注釋結果分析本研究將70,764個unigenes分別與公共數(shù)據(jù)庫TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比對，注釋統(tǒng)計結果見表3-3，比對到各數(shù)據(jù)庫的unigene數(shù)量分別占基因總數(shù)的58.30%、50.50%、43.00%、44.50%、42.80%、11.50%。表3-3Unigene功能注釋成功率統(tǒng)計Table3-3UnigenefunctionannotationsuccessratestatisticsValuesTotalTrEMBLNRPfamKOGGOKONumber7076441249357263041231510302578164100%58.30%50.50%11.50%Percentage43.00%44.50%42.80%3.2.3.1NR注釋結果分析NR庫屬于非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫，比對到NR庫中unigene數(shù)目比例大于1%的物種的分布如圖3-3所示，占總量的比值最大的是擬南芥（Arabidopsisthaliana）為49.6%，其次是水稻（Oryzasativa）占20.9%，集胞藻（Synechocystissp）占1.6%，此外，其他以及未知物種比例為8.6%、2.9%。圖3-3NR庫注釋物種分布圖Fig.3-3AnnotatedspeciesdistributionmapofNR3.2.3.2KOG注釋結果分析本研究中有31,510個unigenes被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫并進行功能分類，這些unigenes覆蓋25個功能類別，其中“基因功能未知”（generalfunctionpredictiononly）基因數(shù)量最多，其次是“翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生”（translation，ribosomalstructureandbiogenesis），“翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴侶蛋白”（posttranslationalmodification，proteinturnover，chaperones）和“信號轉導機制”（signaltransductionmechanisms），具體情況如圖3-4所示。結果表明，測序組裝獲得的unigene幾乎覆蓋了基因的全部功
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本文編號：2880715