發(fā)布時間：2020-10-28 01:24

　　 由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的馬鈴薯黑痣病是一種真菌性病害,嚴重影響馬鈴薯塊莖的產(chǎn)量、外觀品質(zhì)和商品性,以及種薯企業(yè)的種植效益,探索這一病害安全有效的生物防治方法迫在眉睫。本研究通過比較已篩選出的5株生防芽孢桿菌(QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5)分泌促生物質(zhì)的能力以及脂肽類抗生素合成酶基因的檢測,選擇生防潛力最好的菌株,研究其生防效果及其作用機理,并優(yōu)化其發(fā)酵條件后制成生物有機肥,通過盆栽試驗驗證其生防效果。主要研究結(jié)果如下:1.供試生防菌可產(chǎn)生大量的促生物質(zhì),菌株QHZ-3的產(chǎn)量顯著高于其它菌株(1)5株生防菌均可分泌鐵載體,其中以菌株QHZ-3的分泌量顯著高于其它菌株。定量分析結(jié)果顯示,QHZ-3在發(fā)酵液中鐵載體的表達量可達40.59%,比分泌量最小的QHZ-1增加了14.58%;(2)5株生防菌均有一定的解磷能力,對Ca_3(PO_4)_2的溶解能力以QHZ-2、QHZ-3和QHZ-4較強,發(fā)酵液中有效磷的濃度分別為9.89μg/mL、10.53μg/mL和10.19μg/mL,QHZ-1的解磷能力最差,僅為5.16μg/mL;(3)5株生防菌也可產(chǎn)生大量吲哚乙酸(IAA),其中以菌株QHZ-3和QHZ-5的產(chǎn)量最高,分別為17.20mg/mL和16.18 mg/mL,QHZ-2的產(chǎn)量最低,僅為QHZ-3的51%。2.采用分子生物學方法檢測了5株菌的抗生素合成基因,發(fā)現(xiàn)QHZ-1和QHZ-2具有豐原素(Fengycin)和伊枯草菌素(Iturin)合成酶基因;QHZ-4僅具有Fengycin合成酶基因;而QHZ-3與QHZ-5菌株同時具有表面活性素Surfactin、Iturin和Fengycin三種脂肽類抗生素合成酶基因。綜合比較5株生防菌潛在的促生與拮抗能力,選擇最具生防潛力的QHZ-3進一步優(yōu)化發(fā)酵條件、生物有機肥的研制以及生防效果試驗。3.利用LC-MS技術對菌株QHZ-3產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類進行定性,發(fā)現(xiàn)QHZ-3可以分泌Surfactin、Iturin和Fengycin三種脂肽類抗生素。所以,QHZ-3是產(chǎn)脂肽類抗生素菌株。4.菌株QHZ-3的液體及固體發(fā)酵條件優(yōu)化(1)單因素試驗結(jié)果表明,QHZ-3液態(tài)發(fā)酵最佳條件為:裝液量60/250mL三角瓶、接種量6%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時間60h;(2)正交試驗結(jié)果顯示:裝液量40/250 mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速170 r/min、接種量6%、發(fā)酵時間48h的組合下,QHZ-3的生長狀態(tài)最佳,活菌數(shù)可達到1.31×10~(10)cfu·mL~(-1);(3)將QHZ-3接種在腐熟的牛糞有機肥中,采用優(yōu)化的接種量10%制成QHZ-3產(chǎn)脂肽類生物有機肥,活菌數(shù)可達到1.02×10~9 cfu·mL~(-1)。5.盆栽試驗設置3個處理:對照(CK)、QHZ-3菌懸液(QHZ-3)與QHZ-3產(chǎn)脂肽類菌株制成的生物有機肥(BOF)。在馬鈴薯塊莖形成期測定了不同處理中植株地上部和根系的生長情況,以及土壤中病原菌立枯絲核菌的數(shù)量,試驗結(jié)果表明:(1)QHZ-3和BOF處理中馬鈴薯植株的株高、莖粗及生物量等均高于CK。BOF處理的效果顯著優(yōu)于QHZ-3,尤其是對馬鈴薯地下部的生長影響最為顯著,地下部干重比QHZ-3處理增加了1.81倍;(2)QHZ-3和BOF處理也改善了馬鈴薯植株葉片的形態(tài),增加了葉片厚度,并提高了葉片的葉綠素含量(SPAD值)與光合有效輻射,尤其是BOF處理的SPAD值較CK提高了40.3%,較QHZ-3提高了15.91%;(3)BOF顯著改變了馬鈴薯的根系形態(tài):根表面積、根尖數(shù)與根體積等根系參數(shù)均顯著高于QHZ-3和CK,尤其是BOF的根尖數(shù)分別達到了CK和QHZ-3處理的4.11與1.82倍,為馬鈴薯根系的吸收創(chuàng)造了條件;(4)BOF處理顯著降低了馬鈴薯根際土壤中黑痣病病原菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的絕對量。在種植后第60d的定量結(jié)果顯示,BOF處理的馬鈴薯根際土壤中立枯絲核菌的絕對量降至1.34×10~5 copies/g,比CK(1.02×10~6copies/g)降低了一個數(shù)量級。綜上所述,QHZ-3不僅具有顯著的促生作用,而且通過活化土壤養(yǎng)分促進了根系的吸收和生長;QHZ-3通過產(chǎn)生多種脂肽類抗生素抑制了病原菌立枯絲核菌的生長,是一株產(chǎn)脂肽類抗生素菌株的高效生防菌株;以此菌株制成的生物有機肥其作用效果優(yōu)于菌懸液處理,說明生防菌的二次固體發(fā)酵顯著增強了其促生和拮抗能力。
【學位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S435.32;S476.1
【部分圖文】：

產(chǎn)脂肽類菌株QHZ-3對馬鈴薯黑痣病的生防效果及其機理研究21的拮抗機制提供保障，我們對5株菌中抗菌物質(zhì)合成基因的表達進行了測定，結(jié)果如下。注：M，DNA標記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-45株生防菌fenB功能基因的檢測分析結(jié)果Fig.2-4DetectionoffunctionalgenesoffenBfrom5strainsofbiocontrolbacteria如圖2-4所示，所有菌株均擴增出與目的片段（535bp）相同大小的條帶。結(jié)合測序結(jié)果，我們可以確定所有菌株均具fengycin合成酶編碼基因。且5株生防菌中的fenB基因與Bacillussubtilisfengycin合成酶基（L42523.1）同源性分為98%、95.28%、95.34%、95.22%、95.22%。針對抗菌物質(zhì)Iturin，選擇其調(diào)控基因itua基因（616bp）作為合成酶的代表基因進行擴增。檢測結(jié)果如圖2-5所示。注：M，DNA標記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-5五株生防菌ituA功能基因的檢測分析結(jié)果Fig.2-5DetectionoffunctionalgenesofituAfrom5strainsofbiocontrolbacteriaQHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5菌株擴增得到目的片段大小的明亮條帶，QHZ-1、QHZ-2菌株中的ituA基因序列分別與B.atrophaeusUCMB-5137菌株的ituA基因（CP011802.1）同源性達到99%和97%，QHZ-3、QHZ-5與B.atrophaeusGQJK17菌株的ituA基因（CP022653.1）同源性達到99%。結(jié)合測序結(jié)果我們得知，QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5具iturin合成酶編碼基因。200015001000750500250100M12345CKM12345CK200015001000750500250100200015001000750500250100

甘肅農(nóng)業(yè)大學2020屆碩士學位論文22注：M，DNA標記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-65株生防菌srfAA功能基因的檢測分析結(jié)果Fig.2-6DetectionoffunctionalgenesofsrfAAfrom5strainsofbiocontrolbacteria從圖2-6可知，5株生防菌中，QHZ-3與QHZ-5擴增出與目的基因（221bp）一致的明亮條帶，測序結(jié)果與BacillussubtilisSurfactin合成酶基（KC454625.1）同源性分別為97%、98%。因此，QHZ-3與QHZ-5具備Surfactin合成酶基因。上述結(jié)果表明，5株生防菌中可檢測到表面活性素srfAA、伊枯草菌素IturinA、豐原素Fengycin等合成酶基因，因此，5株生防菌株可能通過產(chǎn)生脂肽抗生素抑制病原菌的生長。3.3優(yōu)良生防菌QHZ-3對立枯絲核菌的抑菌效果測定通過上述試驗我們發(fā)現(xiàn)，在5株生防菌中，QHZ-3產(chǎn)生各種促生物質(zhì)的能力均最強，且該菌株存在抑制植物病原菌的3種脂肽類抗生素合成相關基因，推測該菌株可能同時具有抑制細菌性與真菌性病原菌活性的作用，是一株理想的生防菌株，為此，以下試驗采用QHZ-3菌株為試驗對象。圖2-7菌株QHZ-3對馬鈴薯黑痣病病原菌的抑制效果M12345CK200015001000750500250100CK

甘肅農(nóng)業(yè)大學2020屆碩士學位論文26圖2-11QHZ-3菌株3種脂肽類物質(zhì)LC-MS檢測圖Fig.2-11LC-MSforthelipopeptidesantibioticsisolatedfromQHZ-3表2-4QHZ-菌株粗提液中脂肽類抗生素surfactin、iturins以及fengycins分子量測定Table2-4Calculatedmassvaluesofiturins，fengycinsandsurfactinsinculturelipopeptidesextractsfromQHZ-3脂肽類抗生素分子量MM+H*表面活性素SurfactinSurfactinA（C13）1007.61008.7*SurfactinB（C14）1021.71022.8*SurfactinC（C15）1035.71036.7*伊枯草菌素（Iturins）BacillomycinL（C13）1020.51021.5*豐原素FengycinA（C15/Ala-6）1448.81449.7*FengycinsFengycinC（C17/Ala-6）1476.81477.8*“*”：在QHZ-3脂肽類抗生素質(zhì)譜結(jié)果中檢測到相應的質(zhì)子化峰值ThelipopeptidesincorrespondingpeakoflipopeptidesantibioticfromQHZ-3wasdetectedinspectrum
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本文編號：2859356