本文關鍵詞：中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和組織表達分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Sox (SRY-box containing)基因在動物界廣泛存在,目前已在魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)超過100個成員,根據(jù)HMG盒的相似性,將其劃分為A-K 11個亞族。Sox4基因是SoxC亞族成員之一,在胚胎發(fā)育中起著至關重要的作用,主要參與心臟、淋巴細胞、中樞神經系統(tǒng)、內分泌胰島、造血細胞、性腺等多種器官的發(fā)育。Sox7基因屬于Sox家族F亞族,主要參與胚胎發(fā)育和細胞命運的決定。Sox7基因不僅能夠誘導Nodal信號分子、中胚層相關基因以及內胚層分化基因的表達,而且是內胚層Veg-T信號途徑所需的標志物。本研究以中國特有的大型珍稀二級保護物種,唯一尚存的隱鰓鯢科兩棲動物一中國大鯢(Andrias davidianus)為研究對象,采用逆轉錄聚合酶鏈反應(]RT-PCR)及cDNA末端快速擴增(RACE)技術克隆獲得中國大鯢Sox4基因的3個同系物：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因的cDNA序列,對其進行生物信息學分析,并通過熒光定量PCR技術進行各組織間表達情況的分析,主要取得如下結果：1. Sox4a基因的cDNA序列為1153 bp,編碼224個氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū),同源性分析表明中國大鯢Sox4a編碼蛋白與其他物種Sox4a蛋白同源性在63.8%-97.2%之間；對不同物種的Sox4a蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育樹可知：鯉魚(Cyprinus carpio)與施氏鱘(Acipenser schrenckii)從進化樹最先分出,隨后兩棲類的中國大鯢與飾紋姬蛙(Microhyla ornata)聚成一支,鳙魚(Hypophthalmichthys nobilis)與斑馬魚(Danio rerio)最后分出,說明Sox4a基因是一個古老的基因,且從中國大鯢到魚類的進化速度比較快,Sox4a基因的基因復制時間可能在鳙魚與斑馬魚分化之前。Sox4b基因的cDNA序列為1058 bp,編碼193個氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū),同源性分析表明中國大鯢Sox4b編碼蛋白與其他物種Sox4b蛋白同源性在60.3%-97.1%之間；對不同物種的Sox4b蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育樹可知飾紋姬蛙最早從進化樹分出,隨后是鯉魚、瓣結魚(Folifer brevifilis)等幾種魚類,中國大鯢與金線蛙(Pelophylax plancyi)聚成一支最后從進化樹分出。Sox4c基因的cDNA序列為996bp,編碼149個氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū), Sox4c基因目前僅在飾紋姬蛙獲得部分核苷酸片段,將其推導蛋白與中國大鯢Sox4c序列進行比對,兩者同源性高達81.7%。2.Sox7基因的cDNA序列長為847bp,編碼188個氨基酸,位于44-115之間的HMG-box是其主要功能區(qū),中國大鯢Sox7編碼蛋白與其他物種Sox7蛋白同源性在64.1-76.8%之間；對不同物種的Sox7蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育樹可知Sox7基因是一個比較古老的基因,在魚類、兩棲、爬行、哺乳均有存在,中國大鯢與非洲爪蟾、熱帶爪蟾兩棲類聚在一起基本符合物種進化的歷程。3.從NCBI下載、查閱文獻及本實驗室先前所得的中國大鯢Sox基因家族：Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox4c、Sox7、Sox9、Sox11、Soxl4a、Soxl4b、Sox19共11個成員。利用MEGA 5.0軟件,采用鄰接法(Neighbor-joining method)重復1000次對這11個Sox基因成員構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Soxll匯聚在一起分化出來,顯示其較原始的進化地位、Sox9及Sox7聚在一起隨后分出,Sox14的2個同系物、Sox2、Sox19及Sox3最后分出。4.利用熒光定量PCR方法分析中國大鯢Sox4和Sox7基因的組織表達情況,結果顯示：Sox4基因在性成熟的中國大鯢各組織表達量均比較低,相對而言在腸道表達量最高,心臟、卵巢、垂體的表達量次之,肝臟中的表達量極低,腦及腎臟中幾乎不表達。Sox7基因在所有檢測的組織中均有表達,且在腎臟中的表達量最高,腸道、心臟、腦以及卵巢的表達量次之,垂體中的表達量較低,肝臟表達量極低。
【關鍵詞】：中國大鯢 Sox4a Sox4b Sox4c Sox7 基因克隆 表達分析
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S917.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻綜述10-20
• 1.1 Sox基因的概述10
• 1.2 Sox基因的成員與鑒定10-11
• 1.3 Sox基因超家族的特點11-12
• 1.4 Sox基因家族分類及功能12-13
• 1.5 Sox基因超家族的進化13-14
• 1.6 Sox4和Sox7基因的研究進展14-17
• 1.6.1 Sox4基因及其同系物的研究進展14-16
• 1.6.2 Sox7基因的研究進展16-17
• 1.7 研究目的及意義17-20
• 2 材料和方法20-35
• 2.1 實驗材料20-22
• 2.1.1 實驗動物20
• 2.1.2 實驗儀器20
• 2.1.3 試劑及主要試劑的配制20-22
• 2.1.3.1 本研究所用的試劑及菌種20-21
• 2.1.3.2 主要試劑的配制21-22
• 2.2 實驗方法22-35
• 2.2.1 中國大鯢總RNA的提取22-23
• 2.2.2 第一鏈cDNA的合成23-26
• 2.2.2.1 PCR模板的制備23-24
• 2.2.2.2 5’-RACE模板的制備24-25
• 2.2.2.3 3’-RACE模板的制備25-26
• 2.2.3 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因保守片段的克隆26-28
• 2.2.3.1 保守引物設計及合成26
• 2.2.3.2 保守序列的合成26
• 2.2.3.3 PCR產物的回收26-27
• 2.2.3.4 PCR擴增產物與T載體連接反應27
• 2.2.3.5 轉化及篩選送測27-28
• 2.2.4 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因5’-RACE擴增28-30
• 2.2.4.1 5’-RACE引物設計28
• 2.2.4.2 中國大鯢Sox4基因同系物5’-RACE擴增28-29
• 2.2.4.3 中國大鯢Sox7基因5’-RACE擴增29-30
• 2.2.5 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因3'-RACE擴增30-32
• 2.2.5.1 3’-RACE引物設計30
• 2.2.5.2 中國大鯢Sox4基因同系物3’-RACE擴增30-31
• 2.2.5.3 中國大鯢Sox7基因3’-RACE擴增31-32
• 2.2.6 序列分析32
• 2.2.7 熒光定量PCR檢測中國大鯢Sox4和Sox7基因在各組織中的表達32-35
• 2.2.7.1 熒光定量PCR引物設計32-33
• 2.2.7.2 各組織樣品總RNA的提取及cDNA的制備、檢測33
• 2.2.7.3 最適退火溫度的選擇33-34
• 2.2.7.4 標準曲線的制作34
• 2.2.7.5 熒光定量PCR檢測Sox4和Sox7基因表達情況34
• 2.2.7.6 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3 結果與分析35-53
• 3.1 中國大鯢總RNA的提取35
• 3.2 中國大鯢Sox4基因同系物保守片段的克隆35-36
• 3.3 中國大鯢Sox4基因同系物cDNA的克隆及序列分析36-45
• 3.3.1 中國大鯢Sox4基因同系物cDNA的克隆36-37
• 3.3.1.1 Sox4基因的5’端cDNA的克隆36
• 3.3.1.2 Sox4基因的3’端cDNA的克隆36-37
• 3.3.2 Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析37-40
• 3.3.3 Sox4同系物蛋白序列比對、同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建40-45
• 3.3.3.1 Sox4同系物蛋白序列比對41-42
• 3.3.3.2 Sox4同系物蛋白同源性分析42-44
• 3.3.3.3 Sox4同系物蛋白系統(tǒng)進化樹的構建44-45
• 3.4 中國大鯢Sox7基因cDNA的克隆及序列分析45-50
• 3.4.1 S；ox7基因的cDNA的克隆45-46
• 3.4.1.1 Sox7基因的5’端cDNA的克隆45
• 3.4.1.2 Sox7基因的3’端cDNA的克隆45-46
• 3.4.2 Sox7基因的序列分析46-47
• 3.4.3 Sox7蛋白序列比對、同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建47-50
• 3.4.3.1 Sox7蛋白序列比對47-48
• 3.4.3.2 Sox7蛋白同源性分析48-49
• 3.4.3.3 Sox7蛋白系統(tǒng)進化樹的構建49-50
• 3.5 Sox基因超家族進化關系50-51
• 3.6 中國大鯢Sox4和Sox7基因的組織表達分析51-53
• 3.6.1 熒光定量PCR檢測51-52
• 3.6.2 中國大鯢Sox4基因各組織的差異表達結果52
• 3.6.3 中國大鯢Sox7基因各組織的差異表達結果52-53
• 4 討論53-58
• 4.1 中國大鯢Sox4同系物及Sox7基因的序列分析53-55
• 4.1.1 中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析53-54
• 4.1.2 中國大鯢Sox7基因的序列分析54-55
• 4.2 Sox基因超家族進化關系分析55-56
• 4.3 中國大鯢Sox4、Sox7基因在各組織中的表達分析56-58
• 4.3.1 中國大鯢Sox4基因在各組織中的表達分析56-57
• 4.3.2 中國大鯢Sox7基因在各組織中的表達分析57-58
• 5 結論58-59
• 參考文獻59-64
• 致謝64-65
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄65

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  本文關鍵詞：中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和組織表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：284191