【摘要】：透明質酸(Hyaluronic acid, HA)是一種線性、大分子量粘多糖,被廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。獸疫鏈球菌(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)是工業(yè)發(fā)酵生產HA的主要菌株,研究其生物學和代謝機理具有重要意義。基因調控表達是揭示基因功能的有效手段,對獸疫鏈球菌尚缺乏基因誘導表達系統(tǒng),嚴重阻礙基因功能的研究。本研究以獸疫鏈球菌ATCC39920為研究對象,報道四種基于質粒調控的誘導表達系統(tǒng)：蔗糖、乳糖、木糖和乳酸鏈球菌素(nisin)調控的誘導表達系統(tǒng)；并以編碼透明質酸合成酶的hasA基因作為報告基因,以hasA基因功能缺失導致莢膜缺陷的hasA作為宿主菌,觀察誘導后莢膜生成情況驗證系統(tǒng)的可行性；依據(jù)AhasA的特性建立可控的兩步法產HA的發(fā)酵模式。主要研究結果如下：1、構建獸疫鏈球菌ATCC39920穩(wěn)定復制的質粒以pSET4s質粒為出發(fā)載體,成功構建大腸桿菌-獸疫鏈球菌穿梭質粒pLH200,其擁有來源于pWV01質粒的repA基因和用于篩選的壯觀霉素抗性標記。包含pLH200質粒的獸疫鏈球菌在無抗生素壓力條件下培養(yǎng)24 h, pLH200質粒丟失率為0%,表明此質粒用于基礎研究的同時可避免使用抗生素引起的耐藥性變異。2、構建并分析四種誘導表達系統(tǒng)以pLH200質粒為出發(fā)載體,插入scrR-PScrA調控元件,構建蔗糖誘導表達質粒,在PscrA下游插入報告基因hasA,構建蔗糖調控hasA表達質粒pLH200::scrR-PscrA::hasA(pLH201)。分別用lacR-PlacA、xylR-PxylA和nisin-nisR-PnisA調控元件替換scrR-PscrA構建乳糖、木糖、nisin調控的誘導表達質粒。四種誘導系統(tǒng)可行性分析表明：乳糖系統(tǒng)誘導表達效率低；木糖和nisin系統(tǒng)不能誘導基因表達；蔗糖系統(tǒng)可嚴謹且高效誘導基因表達,此誘導系統(tǒng)的成功構建為開展獸疫鏈球菌基因功能的研究夯實了基礎。3、建立可控的兩步法產HA的發(fā)酵模式將pLH201質粒電轉化入△hasA菌株中,構建△hasA/pLH201菌株。此菌株在以葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中不能合成莢膜,解除高粘度發(fā)酵液對溶氧和基質傳遞的限制；其在蔗糖誘導下恢復合成莢膜的能力。據(jù)此本論文提出可控的兩步發(fā)酵模式：在0.12h添加初始濃度為30 g／L的葡萄糖,意在獲得高密度菌體。在12-24 h添加初始濃度為20g/L的蔗糖,意在誘導合成莢膜,收獲HA。經兩步發(fā)酵后,△hasA/pLH201的HA產量為3.4 g／L,而△hasA幾乎檢測不到HA。△hasA/pLH201生物量為2.7 g／L,期望通過深入研究提高其菌體密度,利用此發(fā)酵模式必將提高HA產量。
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S852.611

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本文編號：2803962