【摘要】：容重是一個重要的產(chǎn)量性狀,也是作物超高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)性狀。玉米容重能夠真實地反映玉米的成熟度、完整度、均勻度、籽粒結(jié)構(gòu)緊實度和使用價值,是玉米商品及加工品質(zhì)的重要指標(biāo),是國際貿(mào)易中質(zhì)量定級的重要因素。長期以來,對玉米品質(zhì)的研究大多集中在如何提高營養(yǎng)價值和加工品質(zhì)上,而忽略了商品品質(zhì)尤其是容重對玉米品質(zhì)的影響。對容重這個復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)研究不夠深入,導(dǎo)致我國玉米容重改良進(jìn)展緩慢,嚴(yán)重影響了國際市場的競爭力。課題組前期以容重為研究對象,在玉米第7號染色體上定位到一個主效的QTL,該QTL區(qū)段內(nèi)存在一個重要的候選基因,命名為ZmPOT。功能預(yù)測表明該基因編碼POT家族蛋白,是氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究構(gòu)建了帶有胚乳特異性啟動子GT1的植物過表達(dá)載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar以及TALEN敲除ZmPOT基因的載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米幼胚和胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化,以期建立玉米TALEN敲除體系,并利用過表達(dá)及敲除技術(shù)研究ZmPOT基因的功能。本研究取得如下結(jié)果：1.以B73籽粒總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,克隆了ZmPOT基因。所克隆的ZmPOT序列全長為2084 bp,編碼640個氨基酸,擴(kuò)增的片段與Gramene數(shù)據(jù)庫公布的該基因序列相似性為100%。2.用In-Fusion法將胚乳特異性啟動子Gt1和目的基因分別連接到pCUB骨架載體上,構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar.經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定及表達(dá)載體的序列分析表明,表達(dá)載體構(gòu)建成功。3.為了保證TALEN敲除的特異性,我們在玉米ZmPOT基因的第二個外顯子上設(shè)計了TALEN左右臂靶點。利用質(zhì)粒文庫試劑盒,將TALEN質(zhì)粒模塊分別構(gòu)建到左右臂骨架載體上。4.分別酶切左右臂骨架載體和p CAMBIA1301植物表達(dá)載體,再將TALEN左右臂模塊連接到pCAMBIA1301植物表達(dá)載體上,經(jīng)過酶切鑒定及模塊序列分析表明,表達(dá)載體構(gòu)建成功。5.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCUB-GT1-ZmPOT-bar和TALEN敲除載體分別轉(zhuǎn)化玉米幼胚組織和玉米胚性愈傷組織。經(jīng)除草劑草甘膦和潮霉素篩選后得到具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株,以幼胚為受體得到過表達(dá)載體的To代抗性植株9株,以愈傷組織為受體得到的TALEN敲除載體To代抗性植株146株。6.根據(jù)啟動子區(qū)設(shè)計特異引物,經(jīng)PCR檢測過表達(dá)載體抗性植株基因組DNA,未得到陽性植株。TALEN敲除載體得到陽性植株15株。7將TALEN敲除載體得到的15株To代陽性植株播種到云南,共330株T1代植株,PCR檢測有43株為陽性。T7EI酶切鑒定打靶效率,檢測結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因區(qū)域有打靶發(fā)生。8.運(yùn)用qRT-PCR技術(shù),檢測陽性植株葉片中FokI基因的表達(dá)量,檢測結(jié)果表明部分轉(zhuǎn)基因材料中FokI基因有高表達(dá)。9.對T1代陽性轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行表型測定,結(jié)果表明：陽性轉(zhuǎn)基因植株玉米的粒長和粒寬與對照相比明顯變小。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S513;Q943.2

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本文編號：2788422