【摘要】：香蕉枯萎病(banana vasicular wilt)國(guó)外稱(chēng)巴拿馬病,是由尖鐮孢古巴專(zhuān)化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的極具破壞力的一種土傳真菌病害。Foc種下分為4個(gè)小種,4號(hào)小種不僅寄主范圍廣且破壞力強(qiáng),對(duì)香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的危害。到目前為止,國(guó)內(nèi)外科學(xué)家在香蕉枯萎病病理學(xué)上做了許多卓有成效的研究,完成了Foc1號(hào)和4號(hào)小種的全基因組測(cè)序,克隆了一些致病相關(guān)基因,但其致病分子機(jī)制仍不十分清楚。 本實(shí)驗(yàn)室前期合作完成了Foc1號(hào)和4號(hào)小種的全基因組測(cè)序,并且通過(guò)T-DNA插入建立Focr4突變體庫(kù)。通過(guò)致病性測(cè)定篩選獲得了一批致病性喪失或減弱突變體,對(duì)一批致病性喪失或嚴(yán)重減弱突變體插入失活基因進(jìn)行了拷貝數(shù)驗(yàn)證、插入位點(diǎn)定位和基因cDNA序列克隆。本研究在此工作基礎(chǔ)上,以其中Foc4號(hào)小種致病性喪失突變體Focr4-1366為研究對(duì)象,開(kāi)展了Foc致病性離體葉片快速測(cè)定條件優(yōu)化、Foc4號(hào)小種強(qiáng)致病性野生型菌株分離鑒定；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR方法驗(yàn)證該插入失活基因在野生型菌株中的表達(dá),該基因的敲除載體和互補(bǔ)載體構(gòu)建,從強(qiáng)致病力野生型菌株中對(duì)該基因進(jìn)行敲除和互補(bǔ)驗(yàn)證該基因的致病相關(guān)性,對(duì)獲得的敲除子△Focr4B-1366與互補(bǔ)子△Focr4B-1366-cp進(jìn)行致病相關(guān)生物學(xué)表型觀察。取得了如下5個(gè)方面的研究結(jié)果： (1)對(duì)Foc致病性離體葉片測(cè)定的溫度條件進(jìn)行了優(yōu)化,避免了離體葉片測(cè)定結(jié)果因環(huán)境條件變化而變化的缺陷,提高了Foc致病性測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。 (2)分離獲得了1株致病性強(qiáng)的Foc4號(hào)小種野生型菌株Focr4B。 (3)成功構(gòu)建Focr4-1366插入失活基因的敲除載體和互補(bǔ)載體,對(duì)野生型菌株Focr4B進(jìn)行基因敲除和互補(bǔ)。敲除子喪失了致病性,互補(bǔ)子恢復(fù)了致病性,從而驗(yàn)證了該基因?yàn)橹虏∠嚓P(guān)基因。 (4)通過(guò)對(duì)T-DNA插入突變體Focr4-1366、敲除子△Focr4B-1366、互補(bǔ)子△Focr4B-1366-cp及野生型菌株Focr4B進(jìn)行生物學(xué)表型觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),T-DNA插入突變體Focr4-1366口敲除子△Focr4-1366產(chǎn)孢能力和碳源利用能力較野生型Focr4-B與互補(bǔ)子△Focr4B-1366-cp低,而在菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)、最適溫度、最適合生長(zhǎng)PH值上沒(méi)差別；除互補(bǔ)子△Focr4-1366-cp的孢子萌發(fā)率稍低外,Focr4-B與Focr4-1366、△Focr4-1366孢子萌發(fā)率沒(méi)有差別。初步推測(cè)插入失活基因影響產(chǎn)孢量和碳源的利用,而對(duì)孢子萌發(fā)及菌絲、孢子形態(tài)沒(méi)有顯著的影響。 (5)通過(guò)敲除子△Focr4B-1366,野生型菌株Focr4B產(chǎn)生的粗毒素對(duì)香蕉苗的影響及它們對(duì)細(xì)胞壁降解酶敏感性進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：侵泡在從野生型菌株分泌的發(fā)酵液中,香蕉葉片黃化程度遠(yuǎn)比敲除突變體的嚴(yán)重。說(shuō)明該致病相關(guān)基因與毒素的分泌相關(guān),該基因敲除后影響了Focr4B的毒素產(chǎn)生能力；在相同的酶解時(shí)間,突變體、野生型、互補(bǔ)子釋放的原生質(zhì)體量沒(méi)明顯差別,該基因不影響對(duì)細(xì)胞壁降解酶的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S436.68

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