本文關(guān)鍵詞：藍舌病病毒1型衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及競爭ELISA檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為了探究藍舌病(Bluetongue, BT)亞單位疫苗以及血清學(xué)檢測方法,本研究從以下幾個方面進行了探索：1. 培養(yǎng)BHK-21細胞大量繁殖1型藍舌病病毒(BTV1)病毒液,利用蔗糖密度梯度離心從培養(yǎng)的病毒液中分離純化BTV1,將純化的BTV1滅活與弗氏完全佐劑混合乳化,免疫兔子和綿羊制備BTV多克隆抗體。2. Trizol法從BTV1病毒液提取總RNA,設(shè)計引物RT-PCR克隆BTV1的四個衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,將克隆的目的基因插入pMD18-T載體,構(gòu)建克隆載體TVP2、TVP3、 TVP5、TVP7。3.對克隆載體TVP2、TVP3、TVP5、TVP7和pFastBac HTB載體經(jīng)雙酶切,得到VP2、VP3、VP5、VP7基因和線性化的pFastBac HTB載體；再將四個衣殼蛋白基因插入線性化的pFastBac HTB載體,獲得重組轉(zhuǎn)座載體pVP2、pVP3、pVP5、pVP7;重組轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)化E.coli DH10 Bac感受態(tài)細胞,經(jīng)藍白斑篩選獲得重組桿粒rVP2、rVP3、rVP5、rVP7;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞獲得重組桿狀病毒,用其感染Sf9細胞,分別通過SDS-PAGE和Western-blot檢測蛋白的表達情況及其生物活性,進行重組蛋白的表達和純化。4. 利用表達的VP7重組蛋白,及前期制備的兔抗BTV多克隆抗體和綿羊抗BTV多克隆抗體,初步建立了藍舌病抗體競爭ELISA檢測方法。研究結(jié)果顯示：1. 純化得到了BTV1,免疫動物后獲得的多克隆抗體效價均在1：1024以上2. 克隆的BTV1的四個衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,大小依次為2886bp、2706bp、1581 bp、1050bp,與預(yù)期的結(jié)果相一致。3. 重組的桿狀病毒感染Sf9細胞后,經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析,表達的四個蛋白的大小依次為115 ku、107 ku、61ku、38 ku,能夠與BTV1陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。4. 用建立的抗體競爭ELISA方法對86份樣品進行檢測,其檢測結(jié)果與國家蟲媒病檢測重點實驗室提供的檢測試劑盒相比,結(jié)果完全符合。但是,由于檢測的樣品數(shù)量有限,還需要檢測大量的田間樣品來對檢測方法的特異性和敏感性進行進一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：藍舌病病毒 衣殼蛋白 表達 競爭ELISA
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 藍舌病概述11
• 1.2 藍舌病病毒病原學(xué)研究11-12
• 1.3 藍舌病疫苗的研究進展12-17
• 1.3.1 傳統(tǒng)藍舌病疫苗12-14
• 1.3.2 新型藍舌病疫苗14-17
• 1.4 總結(jié)與展望17-19
• 第二章 BTV1多克隆抗體的制備與衣殼蛋白基因的克隆19-31
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 毒株、動物19
• 2.1.2 菌種、載體、細胞19
• 2.1.3 主要試劑19-20
• 2.1.4 主要儀器20
• 2.1.5 主要溶液和培養(yǎng)基的配置20-21
• 2.2 試驗方法21-25
• 2.2.1 BTV1的細胞培養(yǎng)21
• 2.2.2 BTV1病毒粒子的純化與鑒定21-22
• 2.2.3 BTV1多克隆抗體的制備22
• 2.2.4 BTV1 VP2、VP3、VP5、VP7基因引物的設(shè)計與合成22
• 2.2.5 BTV1 RNA的提取22-23
• 2.2.6 RT-PCR克隆目的基因23
• 2.2.7 目的基因的純化回收23-24
• 2.2.8 目的基因與pMD18-T載體的連接24
• 2.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24
• 2.2.10 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定24-25
• 2.2.11 陽性質(zhì)粒的提取25
• 2.2.12 陽性質(zhì)粒的測序25
• 2.3 試驗結(jié)果25-29
• 2.3.1 純化BTV病毒粒子的SDS-PAGE鑒定25-26
• 2.3.2 衣殼蛋白基因的RT-PCR擴增26-28
• 2.3.3 BTV衣殼蛋白基因的克隆載體的鑒定28-29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 BTV1衣殼蛋白的真核表達與活性鑒定31-48
• 3.1 試驗材料31-33
• 3.1.1 菌種、質(zhì)粒、細胞31
• 3.1.2 主要試劑31-32
• 3.1.3 主要儀器32
• 3.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基的配置32-33
• 3.2 試驗方法33-39
• 3.2.1 感受態(tài)的制備33
• 3.2.2 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pVP2、pVP3、pVP5與pVP7的構(gòu)建及鑒定33-35
• 3.2.3 重組桿粒rVP2、rVP3、rVP5與rVP7的構(gòu)建與鑒定35-36
• 3.2.4 重組桿粒的精提取36-37
• 3.2.5 Sf9細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)37
• 3.2.6 Sf9細胞的馴化37
• 3.2.7 Sf9細胞的懸浮培養(yǎng)37-38
• 3.2.8 重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞38
• 3.2.9 重組桿狀病毒的收獲與培養(yǎng)38
• 3.2.10 重組蛋白的SDS-PAGE與Western blotting分析38-39
• 3.2.11 重組蛋白VP7的表達與純化39
• 3.3 試驗結(jié)果39-46
• 3.3.1 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒菌液PCR鑒定39-41
• 3.3.2 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的雙酶切鑒定41-42
• 3.3.3 重組桿粒的PCR鑒定42-44
• 3.3.4 重組桿粒濃度測定44
• 3.3.5 重組桿狀轉(zhuǎn)染Sf9細胞結(jié)果44
• 3.3.6 重組蛋白的SDS-PAGE分析44-45
• 3.3.7 重組蛋白的Western-blot分析45-46
• 3.3.8 純化重組VP7蛋白的SDS-PAGE分析46
• 3.4 討論46-48
• 第四章 競爭ELISA檢測方法的建立48-52
• 4.1 試驗材料48
• 4.1.1 血清48
• 4.1.2 主要試劑48
• 4.1.3 主要儀器48
• 4.2 試驗方法48-50
• 4.2.1 樣品血清的抗體檢測48-49
• 4.2.2 試劑最佳工作濃度的滴定49
• 4.2.3 競爭ELISA的試驗步驟49-50
• 4.2.4 競爭ELISA的結(jié)果判定50
• 4.3 試驗結(jié)果50-51
• 4.3.1 各試劑最佳工作濃度測試結(jié)果50
• 4.3.2 檢測結(jié)果分析50-51
• 4.4 討論51-52
• 第五章 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻53-58
• 附錄58-59
• 致謝59-60
• 作者簡歷60

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