【摘要】：自然界中,真菌所處的環(huán)境的pH值一直處于不斷變化之中,這種改變對真菌的生長、發(fā)育、次生代謝等生理活動具有非常重要的影響；為了生存和繁衍,真菌必須適應不斷改變的酸堿環(huán)境。因而,研究真菌對酸堿環(huán)境的適應機理,是認知其生命活動規(guī)律的重要內容。本研究在昆蟲病原真菌球孢白僵菌中,克隆了一個酸堿響應轉錄因子的編碼基因BbPacC,通過表達特性檢測、基因敲除、回復突變和超量表達等方法對該基因進行了功能分析,主要結果如下：1.BbPacC基因的克隆與表達特性通過同源克隆的方法獲得BbPacC基因及其上下游序列共3990 bp(Genbank登錄號：JX145340)。序列分析結果顯示,該基因的DNA序列全長為1890 bp,包含2個內含子,其開放閱讀框全長1773 bp,編碼的蛋白含590個氨基酸,預測蛋白的等電點(PI)為8.2,分子量為63.5 kDa。通過對氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),該蛋白分子與蛹蟲草的PacC的同源性達到85%,推測該蛋白為球孢白僵菌的PacC同源蛋白。定量PCR結果表明,在球孢白僵菌生長發(fā)育的早期,BbPacC的表達受到抑制或處于很低的水平；隨著時間延長進入中后期,其表達水平逐漸增加到較高的水平(8倍左右)。進一步研究發(fā)現(xiàn)BbPacC的表達受酸性條件的抑制,受鹽堿條件的誘導,表明BbPacC與菌株鹽堿脅迫相關。2.BbPacC對鹽堿脅迫適應性的影響用CZA培養(yǎng)時,BbPacC敲除菌株在堿性(pH 8.0)及鹽脅迫(1 M NaCl)條件下的生長明顯減慢。通過對鹽脅迫響應蛋白Na+/K+-P型ATPase的基因的啟動子區(qū)域,進行DNA序列分析,結果顯示該區(qū)域含有5個PacC特異識別位點；定量PCR也證實Na+/K+-P型ATPase基因的表達受BbPacC的調控。這些結果表明：BbPacC對菌株的營養(yǎng)生長具有負調節(jié)作用,并可能通過調節(jié)Na+/K+-P型ATPase基因的表達影響菌株的酸堿適應性及耐鹽性。3.BbPacC對生長發(fā)育的影響B(tài)bPacC影響菌絲生長在營養(yǎng)貧瘠培養(yǎng)基(CZB)中,基因敲除菌株生長比野生菌株快,而超量表達菌株的生長卻受到明顯抑制。BbPacC影響分生孢子萌發(fā)和附著胞形成基因敲除菌株分生孢子(10.67 h)的萌發(fā)中時比野生型菌株(9.64 h)延長了1.03 h；觀察附著胞形成率,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株比野生菌株下降了46.96%；表明BbPacC對孢子萌發(fā)和附著胞的形成具有正調節(jié)作用。BbPacC影響分生孢子的形成基因敲除菌株的產(chǎn)孢量比野生型菌株提高了107.34%,而超量表達菌株則下降了17.80%。通過對產(chǎn)孢關鍵基因fluG的啟動子區(qū)域進行序列分析,結果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在PacC蛋白的特異識別位點；并且該基因在BbPacC基因敲除菌株中的表達水平明顯提高,比野生菌株增加近4倍。這些結果表明BbPacC可能通過負調節(jié)的方式調控fluG的表達,進而影響菌株的產(chǎn)孢。4. BbPacC對毒力的影響B(tài)bPacC影響菌株致死率通過體表侵染的方法,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株對大蠟螟幼蟲的半致死時間LT50(123.99 h)較野生型菌株(97.89h)延長了26.66%,而超量表達菌株和野生菌株無明顯差異,表明BbPacC基因參與對菌株的毒力的調節(jié)。BbPacC影響草酸的合成基因敲除菌株發(fā)酵液的草酸含量較野生型降低11.09%,而超量表達菌株草酸含量增加了125.00%。利用溴甲酚紫作為指示劑檢測菌株生長代謝對培養(yǎng)基pH的影響,發(fā)現(xiàn)無論在1/4SDB還是在CZB中,基因敲除菌株所生長的培養(yǎng)基顏色均呈藍色。測定pH顯示,培養(yǎng)基因敲除菌株后的CZB培養(yǎng)基呈中性,而野生型和超量表達菌株的培養(yǎng)基呈酸性。在草酸的生物合成途徑中存在兩個重要基因草酰乙酸水解酶(OAH)和丙酮酸羧化酶(PYC)通過分別對兩個基因啟動子區(qū)域進行DNA序列分析,結果發(fā)現(xiàn)二者均含有PacC蛋白的特異結合位點。定量PCR結果顯示,這兩個基因在BbPacC超量表達菌株中的表達水平顯著高于野生菌株,達到野生菌株的2-6倍。上述結果表明,BbPacC可能通過調節(jié)OAH和PYC基因的表達來影響菌株草酸的合成。BbPacC調節(jié)堿性絲氨酸蛋白酶基因Serp的表達利用脫脂奶粉作為檢測底物觀察菌落水解圈形成情況,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株菌落水解圈大小明顯大于野生菌株,說明敲除BbPacC后,通過改變環(huán)境pH來誘導菌株分泌性蛋白酶基因的表達。通過對堿性絲氨酸蛋白酶Serp基因啟動子區(qū)域進行DNA序列分析,結果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在6個PacC結合位點,而且Serp基因在BbPacC基因敲除菌株中的表達水平明顯提高,而在超量表達菌株中的水平明顯降低。以上結果說明,BbPacC對堿性絲氨酸蛋白酶Serp等基因的表達具有間接調節(jié)作用。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1
【圖文】：

逡逑ｅＭ／．，２００７）。Ｐａｌｌ如何協(xié)助ＰａｌＨ錨定在質膜的呢？有三種可能，如圖１．２所示，（１）逡逑限制ＰａｌＨ的內吞：ＰａｌＨ可能通過內吞的方式到達內膜上，而Ｐａｌｌ為了保證內膜上逡逑ＰａｌＨ分子數(shù)量適中，會阻止過多ＰａｌＨ分子的內吞；（２）促進ＰａｌＨ的回收：Ｐａｌｌ逡逑協(xié)助ＰａｌＨ回到質膜上；（３）協(xié)助ＰａｌＨ脫離高爾基體：Ｐａｌｌ協(xié)助ＰａｌＨ以分泌囊泡逡逑的形式從高爾基體到質膜上。以上三種可能均需要ＰａｌＨ和Ｐａｌｌ有直接或間接的互逡逑作。逡逑曹逡逑＾Ｅｎｄｏｓｏｍｅ邋Ｖｊ邋Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ逡逑（ｋ逡逑Ｖ（邋Ｇｏｌｇｌ邋ｓｔａｃｋｓ逡逑ＴｔｉＬＮＯＳ邋ｔｎ邋Ｍｈ；ｒｏｂ＊ｏｔｃｇｙ逡逑圖１．２邋Ｐａｌｌ促進Ｐａｍ錨定質膜的三種可能機制（Ｐｅｆｉａｌｖａ邋ｅｔａｌ．，邋２００８）．逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｐａｉｌ邋ａｓｓｉｓｔｓ邋ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍａ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰａｌＨ邋ｂｙ邋ｔｈｒｅｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋（Ｐｅｎａｌｖａ邋ｅｔ邋ａ／．，逡逑２００８）．逡逑ｐＨ信號途徑的內膜上存在轉運必需的內體分選復合物（ＥＳＣＲＴ），Ａａｒｏｎ逡逑Ｍｉｔｃｈｅｌｌ團隊在啤酒酵母中的研究，發(fā)現(xiàn)了邋ＥＳＣＲＴ－Ｉ型和ＥＳＣＲＴ－ＩＩ型的所有成分，逡逑以及邋ＥＳＣＲＴ－ｍ邋型的邋Ｖｐｓ３２ｐ￣Ｖｐｓ２０ｐ邋亞基（Ｘｕ邋ｅｔ邋ａｉ，邋２００４）＝邋Ｖｐｓ３２邋結合在內膜上，逡逑與邋ＥＳＣＲＴ－ＩＩ邋型、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ邋型的邋Ｖｐｓ２０邋相互作用（Ｔｅｏ邋ｅｔ邋ａｉ

邐１逡逑０．０５逡逑圖４．１．２邋ＢｂＰａｃＣ與其它真菌Ｐａｃｅ同源蛋白的進化樹分析圖中進行比對分析的真菌分別為蜂綠僵菌（Ｍ逡逑ａｃｒｉｄｕｍ）、金龜子綠僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ邋ａｎｉｓｏｐＵａｅ）、稻曲菌（Ｖｉｌｌｏｓｉｄａｖａ邋ｖｉｒｅｎｓ）、麥角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｐｕｒｐｕｒｅａ、、逡逑深綠木霉（７！邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、哈茨木霉（７！邋ｈａｒｚｉａｎｕｍ）＾鞭毛藻叢赤殼菌邋（Ｎｅｃｔｒｉａ邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、、邋尖孢鐮刀菌逡逑｛Ｆｕｓａｒｉｕｍ邋ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、、輪狀鐮刀菌ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）和稻瘟菌（Ｍ邋ｏｒｙｚａｅ）ｙ黑色框表示球抱白僵菌（５．逡逑ｂａｓｓｉａｎａ）？逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＢｂＰａｃＣ邋ａｎｄ邋ＰａｃＣ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｆｕｎｇｉ．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｃｈａｒｔ邋ｗｅｒｅ邋ｆｒｏｍ邋Ｍ．邋ａｃｒｉｄｕｍ，Ｍ邋ａｎｉｓｏｐｌｉａ’邋Ｖ．邋ｖｉｒｅｎｓ，邋Ｃ．邋ｐｕｒｐｕｒｅａ，邋Ｔ．邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ，邋Ｔ．邋ｈａｎｉａｍｍ，Ｎ．邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ，Ｆ．逡逑ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆ．邋ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅＳｙ邋Ｍ．邋ｏｒｙｚａｅ，邋ｔｈｅ邋ｂｌａｃｋ邋ｂｏｘ邋ｒｅｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋Ｂ．邋ｂａｓｓｉａｎａ．逡逑４．２邋ＢｂＰａｃＣ的表達特性檢n,逡逑在２６°Ｃ，用ＳＤＡ培養(yǎng)，檢測球孢白僵菌在生長和產(chǎn)孢過程中ＢｂＰａｃＣ的表達逡逑情況，發(fā)現(xiàn)該基因的表達水平在菌株生長的早期（３ｄ）較低，隨著時間的延長（６逡逑ｄ、９（１、１２邋ｄ）而逐漸增加

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