本文關鍵詞：荔枝結(jié)合態(tài)過氧化物酶分離純化及其性質(zhì)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：褐變導致荔枝采后品質(zhì)劣變很快,過氧化物酶(POD)是參與荔枝采后褐變的關鍵酶之一。前人已研究了采后褐變過程中可溶性過氧化物酶(SPOD)活性的變化。本試驗以成熟‘烏葉’荔枝為材料,首次測定了荔枝采后結(jié)合態(tài)過氧化物酶(BPOD)活性變化；探索了荔枝果皮BPOD的分離純化體系；應用建立的體系,對荔枝果皮BPOD進行了初步分離純化;并對分離純化得到的BPOD第一組分進行酶學性質(zhì)的初步研究。主要的結(jié)果如下：對與荔枝褐變相關的生理指標進行測定,4℃與25℃貯藏期間,隨著貯藏時間的延長,果皮的褐變指數(shù)上升,但果肉可溶性固形物含量(TSS)幾乎沒有變化,均為16%左右。4℃貯藏,可溶性POD,結(jié)合態(tài)POD活性均是先上升后下降,同工酶譜條帶強弱變化與活性變化一致,但并未出現(xiàn)新的條帶也無原條帶的消失。25℃貯藏條件下,伴隨果實的褐變進程,結(jié)合態(tài)POD活性迅速上升；同工酶電泳結(jié)果顯示,結(jié)合態(tài)POD部分組分的活性顯著增加。通過對荔枝果皮勻漿,棄濾液(可溶態(tài)POD粗酶液),反復懸浮濾渣,再加入含甘油,去垢劑Triton X-100的鹽溶液從荔枝果皮中提取出BPOD粗酶液,并摸索了其在不同層析介質(zhì)上的分離特性,由此建立了荔枝BPOD的分離純化體系：將BPOD粗酶液過Streamline Phenyl柱進行粗分離,再過陽離子交換柱CM-52,疏水作用層析Phenyl Sepharose HP,凝膠過濾層析Superdex 200,得到BPOD的四個組分。對純化后的第一組分進行酶學性質(zhì)的初步研究,其最適pH為6.5,最適溫度為40℃。在H202存在下,對各種底物表現(xiàn)出的活性強弱為：愈創(chuàng)木酚4-甲基鄰苯二酚肉桂醇綠原酸芥子醇鄰苯二酚抗壞血酸沒食子酸表兒茶素對苯二酚焦性沒食子酸；與間苯二酚、芐醇、松柏醇、4-甲氧基酚均無反應。對H202、愈創(chuàng)木酚、4-甲基鄰苯二酚、肉桂醇、芥子醇的米氏常數(shù)分別為16.3mM.26.9mM、4.5mM、30.1 mM、23.7 mM。DTT、ASA、L-半甘氨酸、Cu2+抑制其活性,Ca2+不影響其活性,Mn2+激活其活性,0.1mM EDTA對其活性無影響,1mM EDTA抑制其活性,0.01% TritonX-100激活其活性,0.05%TritonX-100輕微抑制其活性。
【關鍵詞】：荔枝果皮 褐變 結(jié)合態(tài)POD 分離純化 酶學性質(zhì) 同工酶譜
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S667.1
【目錄】：

• 縮略詞表10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 第一章 引言15-28
• 1 荔枝概況15
• 2 采后荔枝果皮褐變的可能機制15-16
• 2.1 失水與褐變15
• 2.2 花色苷與褐變15
• 2.3 酶促褐變15-16
• 2.4 烯與褐變16
• 2.5 微生物與褐變16
• 2.6 其他原因與褐變16
• 3 結(jié)合態(tài)POD的生理功能16-17
• 4 結(jié)合態(tài)POD的提取及分離純化17-24
• 4.1 去垢劑提取結(jié)合態(tài)POD的機理與應用17-20
• 4.1.1 去垢劑的特性17-18
• 4.1.2 去垢劑的增溶機理18
• 4.1.3 去垢劑的選擇18-19
• 4.1.4 去垢劑在結(jié)合態(tài)POD提取中的應用19-20
• 4.2 結(jié)合態(tài)POD的柱層析分離20-23
• 4.2.1 離子交換層析20-21
• 4.2.2 分子篩層析21
• 4.2.3 疏水作用層析21-22
• 4.2.4 親和層析22
• 4.2.5 柱層析在結(jié)合態(tài)POD分離純化中的應用22-23
• 4.3 去垢劑對膜蛋白分析的影響及去除23-24
• 4.4 小結(jié)24
• 5 結(jié)合態(tài)POD的酶學性質(zhì)24-26
• 5.1 結(jié)合態(tài)POD的分子量24-25
• 5.2 結(jié)合態(tài)POD的最適pH25
• 5.3 結(jié)合態(tài)POD的最適溫度及熱穩(wěn)定性25
• 5.4 結(jié)合態(tài)POD對不同底物的親和力25-26
• 5.5 抑制劑對結(jié)合態(tài)POD活性的影響26
• 5.6 金屬離子對結(jié)合態(tài)POD活性的影響26
• 6 本研究的目的及內(nèi)容26-28
• 6.1 本研究目的27
• 6.2 本研究內(nèi)容27-28
• 第二章 荔枝采后果皮可溶性和結(jié)合態(tài)POD活性變化28-36
• 1 材料與方法28-30
• 1.1 材料28
• 1.2 儀器與試劑28
• 1.3 果皮褐變指數(shù)的評定28
• 1.4 果肉可溶性固形物的測定28-29
• 1.5 果皮可溶態(tài)結(jié)合態(tài)POD的提取29
• 1.6 POD活性檢測29
• 1.7 POD同工酶譜29-30
• 2 結(jié)果與分析30-34
• 2.1 果皮褐變指數(shù)的變化30-31
• 2.2 果肉可溶性固形物含量的變化31
• 2.3 果皮可溶態(tài)結(jié)合態(tài)POD活性與同工酶譜變化31-34
• 3 小結(jié)與討論34-36
• 第三章 荔枝結(jié)合態(tài)POD分離純化體系的探索36-50
• 1 材料與方法36-39
• 1.1 材料36
• 1.2 儀器與試劑36
• 1.3 結(jié)合態(tài)POD粗酶液提取及富集36-37
• 1.4 Streamline Phenyl柱層析37
• 1.5 CM-52柱層析37-38
• 1.6 CM-Sepharose HP柱層析38
• 1.7 Phenyl Sepharose HP柱層析38
• 1.8 Superdex 200柱層析38
• 1.9 結(jié)合態(tài)POD活性檢測38
• 1.10 結(jié)合態(tài)POD的Native-PAGE38
• 1.11 結(jié)合態(tài)POD的SDS-PAGE38-39
• 2 結(jié)果與分析39-47
• 2.1 結(jié)合態(tài)POD粗酶液的富集39-40
• 2.2 Streamline Phenyl柱層析的探索40-42
• 2.2.1 洗脫方式的探索40-42
• 2.2.2 去垢劑的選擇42
• 2.3 Streamline Phenyl→CM-52柱層析的探索42-43
• 2.4 Streamline Phenyl→CM-Sepharose HP→Superdex 200柱層析的探索43-46
• 2.5 Phenyl Sepharose HP柱層析的探索46-47
• 3 小結(jié)與討論47-50
• 3.1 結(jié)合態(tài)POD的提取47
• 3.2 Streamline Phenyl柱層析47-48
• 3.3 CM-52柱層析與CM-Sepharose HP柱層析的比較48
• 3.4 Phenyl Sepharose HP柱層析48
• 3.5 結(jié)合態(tài)POD的分離純化順序48-50
• 第四章 荔枝果皮結(jié)合態(tài)POD的分離純化50-56
• 1 材料與方法50-51
• 1.1 材料50
• 1.2 儀器與試劑50
• 1.3 結(jié)合態(tài)POD的提取50
• 1.4 Streamline Phenyl柱層析50
• 1.5 CM-52柱層析50-51
• 1.6 Phenyl Sepharose HP柱層析51
• 1.7 Superdex 200柱層析51
• 1.8 結(jié)合態(tài)POD活性檢測51
• 1.9 結(jié)合態(tài)POD的Native-PAGE51
• 2 結(jié)果與分析51-55
• 2.1 Streamline Phenyl柱層析51
• 2.2 CM-52柱層析51-53
• 2.3 Phenyl Sepharose柱層析53-54
• 2.4 Superdex 200柱層析54-55
• 3 小結(jié)與討論55-56
• 第五章 結(jié)合態(tài)POD酶學性質(zhì)56-65
• 1 材料與方法56-58
• 1.1 材料56
• 1.2 儀器與試劑56
• 1.3 pH對結(jié)合態(tài)POD活性影響的測定56
• 1.4 溫度對結(jié)合態(tài)POD活性影響的測定56
• 1.5 結(jié)合態(tài)POD對底物特異性的測定56-57
• 1.6 結(jié)合態(tài)POD對底物Km值的測定57-58
• 1.7 抑制劑及金屬離子對結(jié)合態(tài)POD活性影響的測定58
• 2 結(jié)果與分析58-62
• 2.1 pH對結(jié)合態(tài)POD活性的影響58
• 2.2 溫度對結(jié)合態(tài)POD活性的影響58-59
• 2.3 結(jié)合態(tài)POD對底物的特異性59-60
• 2.4 結(jié)合態(tài)POD對底物的Km值60-61
• 2.5 抑制劑及金屬離子對結(jié)合態(tài)POD活性的影響61-62
• 3 小結(jié)與討論62-65
• 第六章 總結(jié)與展望65-67
• 1 總結(jié)65
• 2 展望65-67
• 參考文獻67-75

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本文編號：261300