【摘要】：CXCL8是一種CXC趨化因子,可激活和趨化中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等。中性粒細胞可向感染處聚集并參與炎癥反應,該反應受CXCL8的調節(jié),迅速、強烈,是宿主防御的第一道防線。但是,炎癥過程中過量的中性粒細胞浸潤也會導致過度炎癥反應,導致宿主組織細胞被破壞。在大部分豬病發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥是最主要的病理變化,而CXCL8在這些疾病過程中也起重要的作用。大白豬是我國養(yǎng)豬業(yè)重要的豬種之一,目前對大白豬CXCL8的研究報道比較少。本研究克隆了大白豬CXCL8基因,對CXCL8及CXCL8的突變體(G58P)進行可溶性表達,并驗證了它們的生物學活性,為進一步研究豬CXCL8的功能與作用機制,開發(fā)抑制豬炎癥的靶向性藥物提供了基礎。主要研究內容如下:1大白豬CXCL8及G58P的克隆與表達純化提取大白豬肺組織m RNA,利用RT-PCR擴增CXCL8基因。測序正確后將該基因克隆至p GEX-6p-1載體上,獲得重組質粒p GEX-PCXCL8。轉化至大腸桿菌Rosetta中,經表達條件的優(yōu)化,外源基因在上清中高效表達。通過蛋白純化系統(tǒng)AKTA prime 10純化目的蛋白,SDS-PAGE及Western Blot顯示蛋白純化效果較好。將CXCL8第58位甘氨酸(G)突變?yōu)楦彼?P),根據(jù)相應的堿基序列合成CXCL8突變體基因G58P,利用DNA重組技術將其克隆至p GEX-6p-1載體上,按照上述方法表達純化G58P蛋白。2 CXCL8的體內活性驗證將重組蛋白用生理鹽水稀釋到4mg/m L、400μg/m L、40μg/m L、4μg/m L,分別以25μL不同濃度的PCXCL8重組蛋白對BALB/c小鼠進行滴鼻,同時設置相同濃度的GST蛋白對照組及生理鹽水空白對照組。12h后剖殺所有小鼠,取肺進行組織病理學觀察,BALF中性粒細胞計數(shù),肺組織MPO活力檢測來評估重組蛋白的生物學活性。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的PCXCL均可引起小鼠肺炎,4mg/m L GST組有輕微的炎癥,其余濃度GST組與生理鹽水對照組沒有明顯異常;PCXCL8實驗組MPO活力均顯著高于GST對照組及生理鹽水組;4mg/m L PCXCL8滴鼻組BALF中性粒細胞數(shù)目遠遠高于GST組。3 G58P的體內活性驗證實驗組以4mg/m L濃度G58P 25μL劑量滴鼻處理BALB/c小鼠,同時設置PCXCL8陽性對照組,PCXCL8與G58P混合組,生理鹽水對照組,不作處理的空白對照組。12h后剖殺所有小鼠,取肺臟。通過組織病理學觀察,BALF中性粒細胞計數(shù),肺組織MPO活力檢測來評估G58P的生物學活性。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)實驗組、混合組、PCXCL8對照組均呈現(xiàn)肺炎特征,生理鹽水對照組與空白對照組沒有明顯異常;實驗組、混合組、PCXCL8對照組MPO活力無顯著差異,但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組;實驗組、混合組、PCXCL8對照組BALF中性粒細胞數(shù)目無顯著差異,但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組。結論:利用原核表達載體p GEX-6p-1,可以對PCXCL8與G58P進行可溶性表達,所獲得PCXCL8與G58P蛋白都具有良好的生物學活性;PCXCL8第58位氨基酸G-P突變不能對其生物學活性產生重要影響。
【圖文】：

其中 72 個氨基酸的 CXCL8 生物學活性最強，即通常所指的成熟 CXCL8（MoWS etal，1989）。二級結構包括α螺旋和β片層，有肝素交聯(lián)，無糖基，氨基末端和羧基末端均為絲氨酸，等電點為 pH8.0～8.5。X 線晶體衍射與核磁共振顯示其三維結構為六個反向平行的α片層和兩個對稱且反向平行的β螺旋二聚體，如圖 1。各種形式的 CXCL8 均對應有這 72 個氨基酸殘基，在氨基酸的第 7、9、34 和 50 位上均存在 4 個保守的半胱氨酸殘基。天然狀態(tài)下，在第 7 和 34 位（Cys-7/Cys-34）、第9 和 50 位（Cys-9/Cys-50）之間形成鏈內二硫鍵（Baggiolini M et al，1992）。如果這些二硫鍵被還原，則 CXCL8 的活性消失。根據(jù) 4 個半胱氨酸殘基中前兩個殘基排列順序的不同，CXCL8 又可分為α、β兩個亞家族，α亞家族因前兩個半胱氨酸殘基之間插入了一個其他氨基酸殘基，故被稱為 C-X-C 亞家族；β亞家族的前兩個半胱氨酸殘基彼此相鄰，故又稱為 C-C 亞家族（Baggiolini M et al，，1992；David R et a2008；Russo RC et al，2010）。有很多趨化因子都能和 CXCL8 的趨化因子受體CXCR1/CXCR2 結合，稱作 CXCL8 家族趨化因子，它們有一個共同的 ELR+（谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）基序（Russo RC et al，2010；Bachelerie F et al，2013）。研究表明只有哺乳動物的 CXCL8 才帶有 ELR+基序。

圖 3 以 CXCR1 和 CXCR2 為中心介導器官特異性疾病。Fig.3 Central role of CXCR1 and CXCR2 mediating organ-specific pathologies.CXCL8 家族和 CXCR1/2 受體調節(jié)各種特異器官疾病，大多數(shù)有害影響與高度強烈的慢性免疫反應和組織損傷有關，也有一部與實質細胞激活有關（紅色框）。然而，CXCR1/2 受體的激活也能帶來一些積極的影響，例如維持組織穩(wěn)態(tài)，通過 CXCL8 家族的多效作用平衡各種病理組織損傷（藍色框）。CXCL8 family and CXCR1/CXCR2 receptors regulate various specific organs diseases, mos
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S828

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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相關碩士學位論文 前4條

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本文編號：2567105