【摘要】：地黃,一種多年生草本植物,傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其塊根具有極高的藥用價(jià)值,但是,在它的生產(chǎn)過(guò)程中存在極其嚴(yán)重的連作問(wèn)題:種植過(guò)地黃的同一土地8—10年內(nèi)再次種植地黃將導(dǎo)致質(zhì)量和產(chǎn)量急劇下降,這極大限制了地黃的生產(chǎn)。本研究采用高通量測(cè)序結(jié)合定量PCR技術(shù)探究了連作與非連作懷地黃病害發(fā)生時(shí)根際土壤微生物群落的改變;分離得到一些懷地黃致病菌,研究了一些植物益生菌對(duì)這些致病菌的抑制效果;本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究工作中開(kāi)發(fā)出在實(shí)驗(yàn)室條件下能促進(jìn)懷地黃塊根膨大的菌劑,在此基礎(chǔ)上,我們將對(duì)致病菌有抑制作用的植物益生菌復(fù)合到已有菌劑中對(duì)其加以改良,開(kāi)展兩年大田試驗(yàn),分別測(cè)試已有菌劑和改良后菌劑解決懷地黃連作障礙的效果。主要結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:(1)連作與非連作條件下健康和病害懷地黃根際土壤微生物的高通量測(cè)序結(jié)果表明,無(wú)論是頭茬還是重茬,健康和病害懷地黃根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。Proteobacteria、Acidobacteria和Firmicutes是主要的細(xì)菌門(mén),Ascomycota是主導(dǎo)的真菌門(mén)。從屬的水平看,Sphingomonas和Streptomyces等有益細(xì)菌在頭茬和重茬病害懷地黃根際土壤中的含量均低于其在健康懷地黃根際土壤中的含量;Pseudomonas在頭茬和重茬病害懷地黃根際土壤中的含量均高于其在健康懷地黃根際土壤中的含量。真菌群落組成在各個(gè)樣品中差別較大。頭茬健康懷地黃根際土壤中真菌含量較高的屬為Monographella和Thielaviopsis,兩者占據(jù)了頭茬健康懷地黃根際土壤真菌總量的近50%;而在頭茬病害懷地黃根際土壤中Un--s-Hypocreales sp、Un--s-Nectriaceae sp、Myrothecium和Un--s-Ascomycota sp四個(gè)屬含量較多;在重茬健康懷地黃根際土壤真菌組成中,Un--s-Nectriaceae sp、Un--s-Sordariales sp、Un--s-Ascomycota sp、Myrothecium、Phoma的含量最高;在重茬病害懷地黃根際土壤中Un--s-Sordariales sp、Un--s-Ascomycota sp和Un--s-Microascaceae sp處于優(yōu)勢(shì)地位,尤其是Un--s-Sordariales sp,其含量幾乎達(dá)到了41%。綜合兩年的情況,Un--s-Ascomycota sp在病害懷地黃根際土壤中的含量高于其在健康懷地黃根際土壤中的含量;Monographella在病害懷地黃根際土壤中的含量低于其在健康懷地黃根際土壤中的含量。采用定量PCR技術(shù)分別對(duì)健康和病害懷地黃根際土壤中細(xì)菌、真菌的總量及變化明顯的幾個(gè)種屬的微生物進(jìn)行定量,探究病害發(fā)生時(shí)其豐度的具體變化。結(jié)果表明:病害懷地黃根際土壤中總細(xì)菌與總真菌的比值由7.63×109下降至8.70×106,Pseudomonas屬細(xì)菌、F.oxysporum在病害懷地黃根際土壤中的豐度顯著高于其在健康懷地黃根際土壤中的豐度;Sphingomona屬細(xì)菌在頭茬病害懷地黃根際土壤中豐度則低于其在健康懷地黃根際土壤中的豐度。(2)以病害懷地黃組織為材料,分離懷地黃致病菌,共獲得三株霉菌,兩株細(xì)菌和一株酵母菌�；亟釉囼�(yàn)證明這些菌株均對(duì)懷地黃塊根均具有一定的致病性,其中Rhizopus stolonifer、Rhodotorula paludigena、Pseudomonas hibiscicola與已知的兩株致病菌Septoria digitalis Pass、Fusarium solani對(duì)懷地黃塊根均具有100%的致病性。以實(shí)驗(yàn)室原有的混合植物益生菌對(duì)峙高致病性的致病菌,結(jié)果表明,混合菌對(duì)Pseudomonas hibiscicola沒(méi)有作用,對(duì)Rhizopus stolonifer、Enterobacter aerogenes有較弱的抑制作用,對(duì)Septoria digitalis Pass、Fusarium solani、Rhodotorula paludigena均有明顯的抑制作用。(3)第一年的大田試驗(yàn)結(jié)果表明:4種處理方式中處理3平均單株塊根重最大,達(dá)到188.194 g/株,處理1與處理2分別為84.3495 g/株、82.3175 g/株,均極顯著高于對(duì)照的56.3475 g/株,只有處理4低于對(duì)照,為55.4885 g/株,但沒(méi)有達(dá)到顯著性差異。所以,實(shí)驗(yàn)室已有的菌劑以合適的方式施加可以促進(jìn)連作懷地黃塊根膨大,但是不能解決懷地黃嚴(yán)重的病害問(wèn)題。第二年大田試驗(yàn)結(jié)果表明:新菌劑可以顯著提高懷地黃品種京九的平均單株塊根重。
【圖文】：

圖 2-1 樣品群落稀釋曲線（A：細(xì)菌；B：真菌）所有樣品的稀釋曲線在 0-5000 條序列時(shí)快速上升，，5000 條序列之后增速逐漸接近飽和點(diǎn)，曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的序列只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（圖 2-1），而本次測(cè)序深度均達(dá)到 30000 條，所以測(cè)序深度已基本可以覆蓋樣品中的所有微生物，達(dá)到后續(xù)分析要求。（2）OTU 聚類(lèi)及物種注釋概況為了方便快速全面的了解各樣品的 OTU 聚類(lèi)情況和注釋情況，對(duì)各樣品的 OTU 聚類(lèi)和注釋結(jié)果進(jìn)行了綜合統(tǒng)計(jì)。就細(xì)菌而言，13 個(gè)樣品共得到 711347 個(gè)有種屬標(biāo)記的Tags，平均每個(gè)樣品約有 54719 個(gè) Tags（圖 2-2 A），有效數(shù)據(jù)以 97%的一致性（Identity）進(jìn)行 OTUs 聚類(lèi)，13 個(gè)樣品共獲得 50356 個(gè) OTUs。在 G1h2、G1h3、G1d1、G1d2、G1d3、G1d4、G2h1、G2h2、G2h4、G2d1、G2d2、G2d3 和 G2d4 中分別有 4862、4293、4710、4501、2666、3954、3286、3783、3881、3215、3420、3653 和 4132 個(gè) OTUs。真菌方A B

17B圖 2-2 各樣品的 OTUs 聚類(lèi)和注釋情況統(tǒng)計(jì) A：細(xì)菌；B：真菌。橫坐標(biāo)是樣品名；第一縱坐標(biāo)（TagsNumber）是 Tags 數(shù)目；Total Tags（紅色）：指每個(gè)樣品的總的 Tags 數(shù)目（等同于 Effective Tags，每個(gè)樣品用于 OTU 聚類(lèi)等后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)）；Unique Tags（橙色）：指頻數(shù)為 1，并且無(wú)法被聚類(lèi)到 OTUs 的 Tags 數(shù)目（無(wú)法聚類(lèi)到 OTUs 的序列將不用于后續(xù)分析）；Taxon Tags（藍(lán)色）：指用于構(gòu)建 OTUs 并且獲得注釋信息的 Tags 數(shù)目；Unclassified Tags（茶綠色）指沒(méi)有獲得注釋信息的 Tags數(shù)目；第二縱坐標(biāo)（OTUs Number）是 OTUs 的數(shù)目，OTUs（紫色）：指每個(gè)樣品得到的 OTUs 數(shù)目。G1h1 樣品可能因取樣問(wèn)題，得到的 OTU 絕大部分是植物的，所以不用于后續(xù)分析。（3）連作與非連作條件下健康和病害懷地黃根際土壤門(mén)水平的微生物群落組成研究
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S435.672

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2540646