【摘要】：非蛋白質(zhì)氨基酸β-氨基丁酸(DL-β-氨基丁酸,β-Aminobutyric acid,BABA)是一種廣譜化學(xué)誘抗劑,可以誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和逆境脅迫的抗性,且對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染,但缺點(diǎn)是會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成影響,并且成本較高。BABA誘導(dǎo)抗性(BABA-IR)的機(jī)理尚未揭示。最近研究報(bào)道在擬南芥中找到了BABA的受體,即天冬氨酰-tRNA合成酶(AtIBI1)。AtIBI1在結(jié)合了BABA后行使了非傳統(tǒng)的功能——激發(fā)一系列的抗性反應(yīng)。研究顯示BABA抑制生長(zhǎng)是通過(guò)另外一條途徑,因此理論上超表達(dá)BABA的受體可以實(shí)現(xiàn)提高抗性的同時(shí)不抑制植物生長(zhǎng)。本研究依據(jù)At IBI1的蛋白序列,在馬鈴薯中的克隆了BABA的受體StAspRS,獲得超表達(dá)StAspRS的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系;觀(guān)察了轉(zhuǎn)基因株系表型,驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系基礎(chǔ)抗性是否提高;最后通過(guò)酵母雙雜篩選互作蛋白尋找StAspRS的互作蛋白,以揭示天冬氨酰-tRNA合成酶行使抗病功能的機(jī)理。主要結(jié)果如下:1.通過(guò)生物信息學(xué)分析找到馬鈴薯上可能編碼天冬氨酰-tRNA合成酶的所有基因,通過(guò)與At IBI1比較分析,篩選并克隆了馬鈴薯中對(duì)應(yīng)的BABA受體基因StAspRS。熒光定量PCR分析了StAspRS及其三個(gè)同源基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)StAspRS在病原誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá),BABA誘導(dǎo)下沒(méi)有變化。2.得到5個(gè)超量表達(dá)StAspRS的轉(zhuǎn)基因株系,表型觀(guān)察發(fā)現(xiàn),3個(gè)超表達(dá)株系生長(zhǎng)受到抑制,2個(gè)超表達(dá)株系生長(zhǎng)正常。3.挑選生長(zhǎng)正常的轉(zhuǎn)基因株系OE-5和OE-6進(jìn)行一系列晚疫病抗性鑒定,通過(guò)病斑面積、菌絲生長(zhǎng)量、PTI,SA,JA信號(hào)途徑marker基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系晚疫病抗性有一定程度的提高,伴隨基礎(chǔ)抗性相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。4.用StAspRS全長(zhǎng)、StAspRS的N末端片段(StAspRS-N)、StAspRS的C末端片段(StAspRS-C)片段分別進(jìn)行酵母文庫(kù)篩選,結(jié)果表明StAspRS全長(zhǎng)找不到互作蛋白,StAspRS-N可以篩到StAspRS本身C末端片段(第131氨基酸以后的片段),StAspRS-C可以篩到StAspRS本身全長(zhǎng)。StAspRS-N和StAspRS-C還篩到了其他蛋白。點(diǎn)對(duì)點(diǎn)初步驗(yàn)證StAspRS-N和StAspRS-C可以互作,但與全長(zhǎng)StAspRS不能互作。點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證顯示,篩到的7個(gè)其他蛋白中只有vacuolar protein-sorting-associated protein 11 homolog與StAspRS-N互作。
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圖片說(shuō)明： 第三章 結(jié)果與分析3.1 生物信息學(xué)分析馬鈴薯中可能編碼 StAspRS 的基因根據(jù) Luna 等報(bào)道的擬南芥 β-氨基丁酸受體 AtIBI1（At4g31180）的蛋白序列，在 NCBI 中用 protein blast 進(jìn)行比對(duì)，找到一個(gè)相似性高于 70%（380/541）的馬鈴薯 蛋 白 序 列 （ XP_006345989 ）， 編 碼 593 個(gè) 氨 基 酸 。 進(jìn) 一 步 在 PGSC（http://potato.plantbiology.msu.edu）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到 4 條編碼 aspartyl-trna synthetase的序列，序列 ID 分別為：Sotub05g029450.1.1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116。4 個(gè)氨基酸序列與 XP_006345989和 AtIBI1 的 氨 基 酸 序 列 比 對(duì) 如 圖 3.1 所 示 ， AtIBI1 ， XP_006345989 和Sotub05g029450.1.1 相似性很高。Sotub05g029450.1.1 與 XP_006345989 氨基酸比較顯示，Sotub05g029450.1.1 的 N 端有 5 個(gè)氨基酸（XXSPS）插入，，其余部分完全相同。其余 4 個(gè)與 AtIBI1 相似性不高，僅有 30%左右。
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圖片說(shuō)明： http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/。Fig. 3.1 Alignment of five StAspRS protein sequences with AtIBI1.From top to bottom, the protein sequences are as follows: Sotub05g029450.1.1、XP_006345989、AtIBI1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116.Sotub05g029450.1.1、Sotub03g024600.1.1 are from https://solgenomics.net/; XP_006345989 is fromNCBI; PGSC0003DMP400038137、PGSC0003DMP400009116 are fromhttp://solanaceae.plantbiology.msu.edu/.根據(jù) Luna 等的報(bào)道中，AtIBI1 在擬南芥中有一個(gè)同源基因 At4g26870，其編碼氨基酸序列與 AtIBI1 有 84%的相似性，在病原菌 H.arabidopsidis 誘導(dǎo)下，AtIBI1 顯著上調(diào)表達(dá)，而 At4g26870 的表達(dá)沒(méi)有變化。進(jìn)一步的研究表明，At4g26870 不是BABA 的受體。兩者的蛋白序列，差異主要集中在 N 端 extension 區(qū)與 N 端反義密碼子識(shí)別區(qū)，因此，可以推測(cè) AtIBI1 的 N 端結(jié)構(gòu)可能和非傳統(tǒng)的抗病功能有很大關(guān)系。將 AtIBI1，At4g26870，Sotub05g029450.1.1 和 XP_006345989 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖 3.2），可以看出它們之間的差異主要還是集中在 N 端 extension 區(qū)與 N 端反義密碼子識(shí)別區(qū)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S435.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2514523