【摘要】：RNAi是由dsRNA觸發(fā)的高度保守的基因表達調(diào)控機制,在植物和昆蟲中,RNAi是一種主要的抗病毒防御機制。病毒進入宿主后,其復(fù)制過程中形成的dsRNA在宿主RNA酶ⅢDicer2的作用下,被切割成21-23nt的siRNA,siRNA隨后被組裝到RISC中,引導(dǎo)AGO2切割與其互補配對的mRNA,從而阻斷病毒的復(fù)制。然而許多植物和動物病毒也進化出了RNAi的抑制子——VSR,來抑制宿主的抗病毒途徑。這些VSR都是在病毒感染宿主過程中起到重要作用的蛋白,但它們在基因序列和病毒結(jié)構(gòu)上并不保守,而且在RNAi機制中的作用位點也不相同。比如,FHV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以與dsRNA結(jié)合,阻止dsRNA被識別及剪切成siRNA。FHV B2蛋白也可以與siRNA結(jié)合,阻止RISC的組裝。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通過與AGO2蛋白相互作用,阻止RISC的組裝或作用于RNAi的效應(yīng)階段。而最近的研究發(fā)現(xiàn),與AGO蛋白作用的一部分RNA干擾抑制子,通過保守的GW/WG motif與AGO蛋白結(jié)合,從而抑制RNAi應(yīng)答。研究稱,AGO蛋白中發(fā)揮與GW/WG motif結(jié)合功能是PIWI結(jié)構(gòu)域。家蠶核型多角體病毒BmNPV是威脅蠶業(yè)生產(chǎn)的主要病毒,給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來巨大危害。為了促進對BmNPV的感染機制的了解,以開發(fā)應(yīng)對之策,本篇研究對BmNPV能否抑制家蠶的RNAi進行了探索,并對其可能編碼的RNA干擾抑制子進行了預(yù)測以及抑制子功能的鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.BmNPV對BmN4-SID1和BmE細胞中RNAi的抑制作用的檢測體外合成兩條針對螢火蟲熒光素酶的雙鏈RNA——dsFluc1和ds Fluc2,將其與雙熒光素酶報告基因共同轉(zhuǎn)染BmN4-SID1細胞,對酶活的測定結(jié)果顯示,兩條dsRNA均抑制螢火蟲熒光素酶的表達,即其均觸發(fā)RNAi機制。而dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi效應(yīng)強于dsFluc1,因此選擇dsFluc2進行實驗。在未感染的BmN4-SID1細胞中,dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi對螢火蟲熒光素酶的沉默為dsRed的5倍,而在BV病毒感染的細胞中,這種基因沉默的現(xiàn)象基本得到回復(fù),顯示BmNPV可以抑制家蠶BmN4-SID1細胞中的RNAi過程。用dsFluc2與雙熒光素酶報告基因共同轉(zhuǎn)染BmE細胞,發(fā)現(xiàn)其對螢火蟲熒光素酶的干擾為對照dsRed的27倍。而在BV病毒感染的細胞中,螢火蟲熒光素酶基因的沉默也完全得到了回復(fù),顯示BmNPV同樣可以抑制家蠶BmE細胞中的RNAi過程。因此,BmNPV編碼RNAi的抑制子。2.對BmNPV中潛在的RNA干擾抑制子的預(yù)測研究用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的總蛋白中篩選含GW/WG motif的蛋白,分別得到2個、5個和5個含GW/WG motif的蛋白,發(fā)現(xiàn)已報道的這三個病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分別位于其中,證明可以用這種方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。對BmNPV中含GW/WG motif的蛋白進行篩選,共得到16個蛋白,按照功能不同將其分為四類:結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制和表達相關(guān)蛋白、宿主機體調(diào)節(jié)蛋白及其他功能蛋白。這些蛋白在病毒DNA的復(fù)制、完整病毒粒子的組裝、病毒進入宿主以及子代病毒的釋放等過程中分別顯示出重要功能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣殼蛋白orf1629,38K和VP39是構(gòu)成病毒粒子的主要蛋白,并在蛋白進入宿主和出芽過程中起重要作用。P47,DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的復(fù)制,影響病毒增殖。Cystein Protease,Chitinase和p35調(diào)節(jié)宿主細胞狀態(tài),病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制及組裝完成后,需要借助于前兩者對宿主機體的降解和液化來把釋放子代病毒,而受感染的細胞為保護同伴,會啟動“自殺”程序——細胞凋亡來阻止病毒大量擴增,p35則作用于抑制細胞凋亡過程,幫助病毒為所欲為地在宿主體內(nèi)擴增,并且研究發(fā)現(xiàn)p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV組裝及成熟子代病毒產(chǎn)生,PIF1介導(dǎo)ODV進入宿主細胞膜,P43功能未知。另外,用VSR預(yù)測網(wǎng)站對BmNPV的總蛋白進行預(yù)測,篩選出5個預(yù)測值最高的蛋白,分別是DNA Polymerase,ODV-E66,以及作用于病毒基因的復(fù)制和表達過程的IE-1和LEF-3,包膜蛋白orf14。3.抑制子候選基因?qū)NAi的抑制研究及BmAGO2-PIWI domain的表達本次研究對預(yù)測的14個基因進行克隆及表達載體的構(gòu)建,分別是BmNPVp35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein protease、PIF1、orf1629、P47、P43、P48、orf4和VP39。對基因進行T克隆,測序驗證正確后構(gòu)建過表達載體,雙酶切及測序驗證正確顯示過表達載體構(gòu)建成功,得到pSLfa1180[Hr3-A4-Gene-SV40]。orf14通過Gateway方法構(gòu)建到pie2FW載體中。向家蠶細胞中轉(zhuǎn)染過表達載體,定量PCR檢測顯示目標基因均能在細胞中轉(zhuǎn)錄表達。初步選擇9個候選基因進行鑒定,分別是IE1、orf4、P48、p35、LEF-3、orf1629、P47、VP39和P43。同樣借助BmE細胞中ds Fluc2干涉對雙熒光素酶報告基因中螢火蟲熒光素酶基因的沉默現(xiàn)象,向細胞中同時轉(zhuǎn)染過表達載體,Western Blot檢測顯示9個基因均在家蠶細胞中成功表達。檢測其對螢火蟲熒光素酶基因沉默的抑制效果,熒光結(jié)果顯示,orf4、P48、P47和VP39分別造成BmE細胞中RNAi引發(fā)的沉默值下調(diào)67%、67%、53%和64%,其他基因?qū)NAi沒有表現(xiàn)出明顯的抑制效果。由此得出結(jié)論,orf4、P48、P47和VP39發(fā)揮著抑制家蠶RNA silencing效應(yīng)的作用,初步鑒定為BmNPV的干擾抑制子,而其他基因并不發(fā)揮RNAi抑制子的功能。另外,由于一部分含GW/WG motif的RNA干擾抑制子通過與AGO蛋白的PIWI domain作用發(fā)揮功能,因此我們構(gòu)建了BmAGO2-PIWI domain的原核及真核表達載體,可用來進行pull-down和免疫沉淀實驗釣取BmNPV中的RNA干擾抑制子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S884.51

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 趙潔;劉小寧;;RNAi在昆蟲控制領(lǐng)域的研究進展[J];中國植保導(dǎo)刊;2015年01期

2 施秀珍;吳青君;王少麗;徐寶云;謝文;張友軍;;RNA干擾在昆蟲中的作用機理及應(yīng)用進展[J];生物安全學(xué)報;2012年03期

3 景天忠;董瀛謙;王志英;;ICTV報告VⅢ以來昆蟲病毒分類上的變化[J];中國生物防治學(xué)報;2011年02期

4 韋永龍;李軼女;張志芳;沈桂芳;;桿狀病毒表達系統(tǒng)及其應(yīng)用進展[J];生物技術(shù)通報;2010年10期

5 楊廣;尤民生;趙伊英;劉春輝;;昆蟲的RNA干擾[J];昆蟲學(xué)報;2009年10期

6 何正波;陳斌;馮國忠;;昆蟲RNAi技術(shù)及其應(yīng)用[J];昆蟲知識;2009年04期

7 張志芳;呂鴻聲;吳祥甫;;昆蟲桿狀病毒復(fù)制的分子生物學(xué)[J];國外農(nóng)學(xué)(蠶業(yè));1994年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 蔣亮;基于轉(zhuǎn)基因工程的家蠶核型多角體病毒（BmNPV）抗性素材創(chuàng)新及抗性機制研究[D];西南大學(xué);2013年

，

本文編號：2382521