【摘要】：近年來(lái),由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarfvirus,RGDV)引起的水稻瘤矮病在我國(guó)廣東、福建、海南省稻區(qū)發(fā)生流行,成為我國(guó)南方稻區(qū)的重要病害之一,對(duì)水稻產(chǎn)量造成影響。RGDV隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus),主要由介體電光葉蟬以持久增殖方式進(jìn)行傳播。目前,對(duì)RGDV的研究主要集中在基因組結(jié)構(gòu)與功能、寄主及介體細(xì)胞內(nèi)的侵染概況等,關(guān)于RGDV在介體電光葉蟬內(nèi)進(jìn)行垂直傳播的研究很少。本研究通過(guò)預(yù)設(shè)帶毒情況不同的雌雄電光葉蟬進(jìn)行群體交配并檢測(cè)子代的帶毒率,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,帶毒雌蟲(chóng)與無(wú)毒雄蟲(chóng)交配時(shí),子代帶毒率為18%左右。然而,當(dāng)帶毒雄蟲(chóng)與無(wú)毒雌蟲(chóng)交配時(shí),子代帶毒率可高達(dá)到70%左右。明確帶RGDV的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)都能將病毒傳給子代,并且雄蟲(chóng)在垂直傳播中起重要作用。1、RGDV經(jīng)雌性垂直傳播本課題組前期通過(guò)免疫熒光標(biāo)記及電鏡觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)在電光葉蟬雌蟲(chóng)體內(nèi)RGDV可能借助非結(jié)構(gòu)蛋白Pnsl1裝配形成的管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行經(jīng)卵傳播,但對(duì)于其中的機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)免疫熒光及透射電鏡觀(guān)察,推測(cè)Pns11管狀結(jié)構(gòu)可能與電光葉蟬肌動(dòng)蛋白(Actin)相互作用來(lái)推動(dòng)小管克服卵傳屏障。通過(guò)雙鏈RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)抑制帶毒電光葉蟬體內(nèi)Pns11表達(dá),同時(shí)設(shè)置干擾GFP蛋白表達(dá)為對(duì)照組。解剖干擾后雌性電光葉蟬的生殖系統(tǒng),通過(guò)Western Blot檢測(cè)雙鏈RNA干擾對(duì)Pns11蛋白表達(dá)量的影響。選取干擾效果明顯的批次進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn),檢測(cè)親代個(gè)體和子代的帶毒率。結(jié)果表明干擾交配的帶毒雌性體內(nèi)Pns11的表達(dá),子代帶毒率僅為5.3%,與對(duì)照組21%相比顯著降低。此外,通過(guò)GST pull-down、酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 Pns11與電光葉蟬Actin之間存在特異性互作。進(jìn)一步證實(shí),RGDV侵入電光葉蟬卵細(xì)胞可依靠Pns11管狀結(jié)構(gòu)與Actin的相互作用來(lái)提供小管穿過(guò)濾泡細(xì)胞和微絨毛骨架等入卵屏障的動(dòng)力。2、RGDV經(jīng)雄性垂直傳播通過(guò)群體交配實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帶毒雄蟲(chóng)在垂直傳播病毒的過(guò)程中起重要的作用。免疫熒光標(biāo)記和電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)RGDV病毒粒體主要是粘附于精子的精核表面。實(shí)驗(yàn)室同期研究采用原核表達(dá)的RGDV編碼的外殼蛋白(P2、P8)及非結(jié)構(gòu)蛋白Pns11預(yù)先體外預(yù)孵育健康電光葉蟬精子,然后再進(jìn)行提純病毒孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RGDV P8可以體外結(jié)合在精核質(zhì)膜表面。為了探究RGDV P8粘附于精核質(zhì)膜表面的作用機(jī)制,我們用GST pull-down技術(shù)從精子可溶性總蛋白中"釣取"與RGDV P8相互作用的精子蛋白。結(jié)果從電光葉蟬精子蛋白中"釣取"出與RGDVP8發(fā)生互作的高密度脂蛋白結(jié)合蛋白(Vigilin)、硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)等十種候選互作蛋白。利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中驗(yàn)證了 RGDV P8與HSPG及Vigilin蛋白之間確實(shí)存在互作。當(dāng)RGDVP8與HSPG共表達(dá)時(shí),二者完全共定位于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)以及核膜周?chē)．?dāng)RGDV P8與Vigilin共表達(dá)時(shí),二者均勻的彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中并且完全共定位。運(yùn)用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),明確RGDV P8與精子Vigilin及HSPG蛋白可以在本氏煙中互作發(fā)出黃色熒光。通過(guò)本氏煙共定位實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到RGDV P8蛋白與精子的Vigilin主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞骨架上,與HSPG主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。綜上所述,本研究初步證明RGDV不僅可以通過(guò)雌蟲(chóng)將病毒傳遞給子代,還可以通過(guò)雄蟲(chóng)進(jìn)行垂直傳播且起到重要的作用。帶毒雌蟲(chóng)可通過(guò)病毒編碼的Pns11與電光葉蟬自身的Actin發(fā)生互作,為包裹病毒粒體的Pns11管狀結(jié)構(gòu)提供突破入卵屏障的動(dòng)力。帶毒雄蟲(chóng)垂直傳播RGDV主要是通過(guò)病毒編碼的P8蛋白與精核質(zhì)膜表面的Vigilin及HSPG等蛋白發(fā)生互作,粘附在精子表面隨受精過(guò)程進(jìn)入卵內(nèi)傳播至子代。因此,本研究對(duì)RGDV侵染電光葉蟬卵細(xì)胞及借助精子細(xì)胞為載體進(jìn)行垂直傳播的機(jī)制進(jìn)行了初步的研究,為阻斷RGDV垂直傳播提供新的思路和理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S435.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2342491