【摘要】：鐵是參與植物呼吸作用和光合作用等一系列生命活動(dòng)的必需微量金屬元素,對(duì)植物發(fā)揮正常生理代謝功能至關(guān)重要。由于其在土壤中多以可溶性極低的氧化物形式存在,并不能使植物直接吸收利用,因此植物缺鐵是農(nóng)業(yè)中普遍存在的問題。缺鐵脅迫不僅阻礙植物生長,影響籽粒中的鐵含量的積累,干擾植物對(duì)土壤條件的耐受性和適應(yīng)性,而且它還會(huì)通過食物鏈直接影響到人類自身的鐵營養(yǎng)水平。了解鐵在植物內(nèi)的代謝平衡規(guī)律是解決植物缺鐵問題的基礎(chǔ),解決植物缺鐵問題又是改善動(dòng)物和人類鐵營養(yǎng)的關(guān)鍵。番茄是世界各地廣泛栽培的一種重要的蔬菜作物。因此,番茄鐵分子代謝機(jī)制的研究已成為當(dāng)今植物界的研究熱點(diǎn)。本課題研究了不同鐵含量的營養(yǎng)液對(duì)番茄幼苗生理形態(tài)指標(biāo)的影響,結(jié)果表明,在不同的鐵濃度供給下,番茄幼苗形態(tài)和生理指標(biāo)差異明顯,缺鐵處理(OmMEDTA-Fe)會(huì)顯著抑制番茄幼苗的生長,并且隨著脅迫時(shí)間增加,抑制生長的效應(yīng)愈加明顯;而高鐵(200mMEDTA-Fe)處理的番茄幼苗與正常處理(100mMEDTA-Fe)和缺鐵處理相比,在根活、葉綠素含量和丙二醛含量方面表現(xiàn)更佳,整體表現(xiàn)出促進(jìn)番茄幼苗的生長。本研究通過查詢NCBI,根據(jù)SlFRD3基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,克隆獲得鑒定了該基因。本研究利用熒光定量PCR研究了SlFRD 在番茄根、莖、葉、花和果實(shí)中中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示該基因在番茄根中表達(dá)量最高,其次為葉、莖、成熟果(花后38-40d)、花、幼果(花后8-10d)、膨大果(花后28-30d)、青果(花后18-20d);在不同鐵濃度下SlFRD3在不同部位隨處理時(shí)間的表達(dá)差異。結(jié)果顯示:在處理96h內(nèi)的番茄根中,隨著處理時(shí)間增加,三種濃度鐵處理的番茄根中SlFRD3基因表達(dá)量都出現(xiàn)了升高,這可能和根系的生長有關(guān);同時(shí)和正常鐵處理相比,缺鐵脅迫不影響SlFRD3基因的表達(dá),而高鐵脅迫則表現(xiàn)出促進(jìn)SlFRD3基因的表達(dá);在葉中,正常處理隨處理時(shí)間的增加,表達(dá)量差異不顯著;缺鐵處理在8h內(nèi)會(huì)使SlFRD3基因表達(dá)升高,然后隨著處理時(shí)間增長,表達(dá)量有所降低,高鐵處理則在32h內(nèi)緩慢升高,32h到72h又緩慢降低,96h又出現(xiàn)升高。高鐵脅迫比缺鐵脅迫誘導(dǎo)SlFRD3基因表達(dá)量顯著增加。本研究對(duì)SlFRD3蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,表明其分子式為C2613H4170N652 0703S21,分子量為56641D,等電點(diǎn)為9.19,是一種可溶性蛋白;無信號(hào)肽位點(diǎn),穩(wěn)定系數(shù)為29.38,是穩(wěn)定蛋白;平均親水系數(shù)為0.652,存在12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,是跨膜蛋白。含有兩個(gè) MatE(PF01554)(158-259,316-475)和一個(gè) Polysacc synt C(PF14667)(212-341)結(jié)構(gòu)域,屬于典型的MATE家族。SlFRD3蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果為48.76%的α-螺旋,21.9%。的延長鏈,8.95%的β3-轉(zhuǎn)角,20.38%的隨機(jī)卷曲。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)番茄SlFRD3與潘娜麗番茄、馬鈴薯、辣椒、煙草、美花煙草和茸毛煙草的相關(guān)蛋白等親緣關(guān)系較近,但與水稻和擬南芥等生物學(xué)模式作物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),氨基酸序列比對(duì)不在一個(gè)分支,表明番茄SlFRD3蛋白和現(xiàn)在已經(jīng)研究較多的擬南芥AtFRD3蛋白、水稻OsFRDL1蛋白等在行使檸檬酸木質(zhì)部加載轉(zhuǎn)運(yùn)功能的過程可能有些不同。本研究克隆了SlFRD 基因一段長為1831bp的一段啟動(dòng)子片段,構(gòu)建了PBl121-SlFRD3P融合表達(dá)載體。啟動(dòng)子預(yù)測分析軟件Plantcare分析了順式作用原件,預(yù)測結(jié)果表明,有很多重要的順式作用元件位于SlFRD3基因的這一啟動(dòng)子區(qū)。在此序列中除了存在能使轉(zhuǎn)錄精確起始的TATA-box,和控制著起始的頻率CAAT-box等核心啟動(dòng)子元件外,還存在著2種與脅迫相關(guān)的作用元件,分別參與熱應(yīng)激和防御脅迫;6種與激素相關(guān)的作用元件,它們是分別是參與茉莉酸、乙烯、赤霉素和水楊酸的相關(guān)反應(yīng);還有多個(gè)與組織特異性相關(guān)的元件,如參與和調(diào)節(jié)胚乳表達(dá)的作用元件;以及一些最大激發(fā)劑介導(dǎo)的激活元件等,為后續(xù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化鑒定SlFRD3基因的亞細(xì)胞定位以及SlFRD3基因啟動(dòng)子調(diào)控的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Iron is an essential trace metal element involved in a series of life activities, such as respiration and photosynthesis, and it is very important for plants to play a normal physiological and metabolic function. Iron deficiency stress not only hinders plant growth, affects iron accumulation in grains, interferes with plant tolerance and adaptability to soil conditions, but also directly affects the iron nutrition level of human beings through the food chain. Understanding the iron metabolism balance in plants is the basis to solve the problem of iron deficiency in plants and solve the problem of planting. The problem of iron deficiency is also the key to improve iron nutrition of animals and humans.Tomato is an important vegetable crop widely cultivated all over the world.Therefore, the study of iron metabolism mechanism of tomato has become a hot topic in the plant field.The effects of different iron content nutrient solution on physiological and morphological indexes of tomato seedlings were studied. The results showed that the morphological and physiological indices of tomato seedlings were significantly different under different iron concentrations. Iron deficiency treatment (OmMEDTA-Fe) could significantly inhibit the growth of tomato seedlings, and the inhibition effect became more obvious with the increase of stress time; while iron deficiency treatment (200 mMEDTA-Fe) could significantly inhibit the growth of tomato seedlings compared with normal treatment (100 mMEDTA-Fe) and iron deficiency treatment (100 mMEDTA-Fe). In this study, the gene was cloned and identified by inquiring NCBI and designing specific primers according to the coding region of SlFRD3 gene. In this study, quantitative PCR was used to study the SlFRD in tomato roots, stems, leaves, flowers and fruits. The results showed that the expression of the gene in tomato root was the highest, followed by leaves, stems, mature fruits (38-40 days after anthesis), flowers, young fruits (8-10 days after anthesis), expanded fruits (28-30 days after anthesis), green fruits (18-20 days after anthesis); the expression of SlFRD3 in different parts of tomato was different under different iron concentrations with different treatment time. In roots, the expression of SlFRD3 gene increased with the increase of treatment time, which may be related to root growth. Compared with normal iron treatment, iron deficiency stress did not affect the expression of SlFRD3 gene, while iron stress promoted the expression of SlFRD3 gene in leaves. The expression of SlFRD3 gene increased within 8 hours after iron deficiency treatment, then decreased with the increase of iron deficiency treatment, increased slowly within 32 hours, decreased slowly from 32 hours to 72 hours, and increased again at 96 hours after iron deficiency treatment. The bioinformatics analysis of SlFRD3 protein showed that its molecular formula was C2613H4170N652 0703S21, its molecular weight was 566441D, its isoelectric point was 9.19, and it was a soluble protein; the signal-free peptide site, its stability coefficient was 29.38, it was a stable protein; the average hydrophilic coefficient was 0.652, there were 12 transmembrane domains, and it was a transmembrane protein. E (PF01554) (158-259,316-475) and a polysacc synt C (PF14667) (212-341) domain belong to the typical MATE family. The secondary structure of SlFRD3 protein was predicted to be 48.76% alpha-helix, 21.9%. The elongated chain, 8.95% beta-3-rotation, 20.38% random curl. Amino acid sequence alignment and evolutionary tree analysis revealed that tomato SlFRD3 and Panari were related to each other. The relative proteins of tomato, potato, pepper, tobacco, American flowering tobacco and pubescent tobacco are close, but they are far from the biological model crops such as rice and Arabidopsis. Amino acid sequence alignment is not a branch, suggesting that tomato SlFRD3 protein and Arabidopsis AtFRD3 protein, rice OsFRDL1 protein have been studied extensively. This study cloned a 1 831 BP promoter fragment of the SlFRD gene and constructed a PBl121-SlFRD3P fusion expression vector. Acting elements are located in the promoter region of the SlFRD3 gene. In addition to TATA-box, which can make transcription start accurately, and core promoter elements such as CAAT-box, which control the initiation frequency, there are also two stress-related elements involved in heat stress and stress resistance, and six hormone-related elements. They are involved in the reactions of jasmonic acid, ethylene, gibberellin and salicylic acid, as well as many tissue-specific elements, such as those involved in and regulating endosperm expression, and some of the largest activator-mediated activating elements, for further transformation to identify the subcellular localization of the SlFRD3 gene and the SlFRD3 group. It laid the foundation for the study of promoter regulation.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S641.2

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本文編號(hào)：2183608