本文關鍵詞：文昌魚抗菌肽基因的鑒定和功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國海洋大學》 2015年

文昌魚抗菌肽基因的鑒定和功能研究

劉浩涵  

【摘要】：文昌魚是一種重要的模式生物,被認為是從無脊椎動物到脊椎動物間的過渡物種,有著重要的進化地位。抗菌肽是構成生物體先天性免疫的重要組成成分,能快速高效殺死入侵病原體,也是目前應對由于抗生素濫用所引起的細菌抗藥性問題的重要替代途徑之一。本文以青島文昌魚為研究對象,成功從其cDNA文庫中鑒定出一種新型抗菌肽基因,并對組織分布,以及編碼的成熟肽的功能及其抑菌機制進行研究。本文依據(jù)進化關系較近物種間抗菌肽基因所編碼的前體肽的信號肽序列高保守性這一特點,以盲鰻(Myxine glutinosa)抗菌肽HFIAP-1的信號肽為檢索條件,通過生物信息學分析,在佛羅里達文昌魚數(shù)據(jù)庫中確定了一條預測的抗菌肽基因序列,并從青島文昌魚cDNA文庫中成功克隆出目標抗菌肽基因Bjampl的完整ORF,化學合成其編碼的成熟抗菌肽多肽段mBjAMP1,研究了mBjAMP1的抑菌功能,并對其抑菌機制和溶血性、細胞毒性進行了探索。通過生物信息學分析,我們確定了青島文昌魚的一條抗菌肽目標序列Bjampl,采用PCR及RACE技術成功克隆出該基因完整ORF。組織分布表明,Bjampl主要在腸、鰓、肝盲囊、肌肉、脊索中大量表達,而在精巢和卵巢中表達較少。經(jīng)LPS/LTA處理后,其表達量在脊索、肌肉、肝盲囊中的表達量顯著升高,表明Bjampl可能參與到了文昌魚的免疫反應之中。Bjampl的完整ORF長294 bp,編碼一條包含97個氨基酸殘基的多肽鏈；經(jīng)分析,該多肽鏈氨基端的前24個氨基酸殘基構成信號肽,中間為一段陰離子富集區(qū),羧基端為一陽離子富集區(qū)。經(jīng)預測,成熟抗菌肽為位于R75R76雙堿性氨基酸殘基剪切位點之后的由21個氨基酸殘基構成的多肽段,并命名為mBjAMP1,其分子質量為2.5 KDa,等電點為11.6,疏水性氨基酸殘基比例為38%,靜電荷為+6,含有兩段α螺旋結構。采用化學合成法合成了該21氨基酸殘基構成的多肽段mBjAMP1,并對其羧基端進行了酰胺化處理。通過圓二色性光譜(CD)實驗證明,在PBS溶液中,mBjAMP1以一種無規(guī)卷曲的構象存在,而處于SDS,三氟乙醇(TFE)這些細菌細胞膜模擬環(huán)境中時,則呈現(xiàn)出a螺旋構象,這表明,nBjAMP1在與細胞膜接近時,可能經(jīng)歷了一個由無規(guī)卷曲向a螺旋的構象轉變過程。抑菌實驗表明,mBjAMP1對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均具有抑菌效果,實驗中各種細菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為：金黃色葡萄球菌(S. aureus) 6.3μg/ml、藤黃微球菌(M. Luteus) 6.3μg/ml,大腸桿菌(E. coli) 6.3μg/ml、鰻弧菌(V. anguillarum) 12.5μg/ml。細胞膜的去極化實驗結果顯示,mBjAMP1可引起大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜的去極化作用,且引起去極化的速度和程度呈現(xiàn)濃度依賴性。這表明mBjAMP1在發(fā)揮抑菌功能時,會作用于細菌的細胞膜上,引起細菌細胞膜上電位的改變,從而導致去極化作用的發(fā)生。細胞膜通透性改變實驗中,被mBjAMP1處理后的細菌細胞膜的通透性相對于未處理組有顯著增加,且呈現(xiàn)出濃度依賴性。這表明,mBjAMP1作用于細菌時,破壞了其細胞膜的完整性,使其通透性增加,進而抑制細菌的生長繁殖,進而導致細菌的死亡。酶聯(lián)吸附試驗(ELISA)證明mBjAMP1能夠與病原分子模式LPS、LTA特異性結合,其可能是一種病原分子模式識別受體。在透射電鏡實驗中我們觀察到,細菌的細胞壁遭到了嚴重破壞,細胞質變得透明化,同時,細菌細胞膜表面不再平滑,在處理組的金黃色葡萄球菌細胞膜表面出現(xiàn)多處明顯凹陷的小洞。這表明mBjAMP1與細菌作用時,破壞了細菌的細胞壁,并可能在細胞膜上形成孔洞。溶血實驗和細胞毒性實驗(MTT比色法)表明,mBjAMP1不具有溶血性和細胞毒性。綜上,我們判定,Bjamp1是青島文昌魚的一個抗菌肽基因,由其編碼的成熟肽nBjAMP1是一個對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑菌效果,通過破壞細胞膜完整性的方式發(fā)揮抑菌活力,且無溶血性和細胞毒性的陽離子抗菌肽。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

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【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 黎觀紅;洪智敏;賈永杰;瞿明仁;;抗菌肽的抗菌作用及其機制[J];動物營養(yǎng)學報;2011年04期

2 王磊;宿紅艷;王昌留;王艷華;;從無脊椎動物到脊椎動物的紐帶——頭索動物文昌魚[J];海洋湖沼通報;2007年02期

3 方永強;文昌魚生態(tài)習性及其資源的保護[J];動物學雜志;1987年02期

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬丹;楊帆;方軍;王樹玲;李兆申;柏愚;;腸道菌群及防御素在結直腸癌發(fā)病中的作用[J];世界華人消化雜志;2015年33期

2 王璐;肖梨;虞霖田;沈鑫;殷中瓊;;注射誘導次數(shù)對黃粉蟲抗菌肽含量及體外抑菌效果的影響[J];畜禽業(yè);2015年07期

3 但啟雄;袁威;李剛;胡洋;鄧惠丹;任志華;田春雷;金海濤;鄧又天;鄧俊良;;復合抗菌肽對斷奶仔豬血清抗氧化功能的影響[J];中國獸醫(yī)學報;2015年05期

4 白建勇;宦海琳;閆俊書;溫超;周巖民;周維仁;;抗菌肽對發(fā)酵床飼養(yǎng)仔豬抗氧化指標、免疫指標及腸道主要菌群數(shù)量的影響[J];家畜生態(tài)學報;2015年05期

5 姜玉松;張文琪;樊汶樵;徐敬明;;棘腹蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin-Pb的克隆及表達分析[J];淡水漁業(yè);2015年04期

6 陳連民;陳前嶺;王夢芝;;牛奶體細胞數(shù)的影響因素及其調控技術[J];飼料工業(yè);2015年07期

7 李蘭洲;張爽;王娟;滕利榮;曹尚;王迪;;林蛙抗菌肽的制備及抑菌活性研究[J];食品安全質量檢測學報;2015年03期

8 王浩波;;抗菌肽的研究進展及其在動物生產(chǎn)中的應用[J];畜牧與飼料科學;2015年01期

9 白建;杜京旗;弓玉紅;王瑞;劉寶琦;;日糧添加海藻粉和抗菌肽對海蘭褐蛋雞免疫功能的影響[J];飼料研究;2014年23期

10 楊田田;于龍魅;劉二強;陳香君;朱明星;王秀青;;天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對小鼠小腸黏膜結構、小腸黏膜免疫功能和腸道菌群的影響[J];動物營養(yǎng)學報;2014年11期

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉倚帆;徐良;朱海燕;張立可;汪以真;;抗菌肽與抗生素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的體外協(xié)同抗菌效果研究[J];動物營養(yǎng)學報;2010年05期

2 黎觀紅;張錦華;瞿明仁;游金明;;乳鐵素——來源于乳鐵蛋白的多功能抗菌肽[J];中國生物化學與分子生物學報;2009年09期

3 王磊;宿紅艷;馮培勇;張士璀;;文昌魚與比較基因組學和分子發(fā)育生物學[J];海洋湖沼通報;2005年04期

4 王義權;方少華;;文昌魚分類學研究及展望[J];動物學研究;2005年06期

5 周聯(lián),俞瑜;防御素與先天性免疫及獲得性免疫[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);2005年02期

6 邱曉燕,劉艷,陳小麟,陳奕欣;舍蠅抗菌肽的提取及其對腫瘤細胞生長的抑制作用[J];中華衛(wèi)生殺蟲藥械;2003年01期

7 張士璀,吳賢漢;從文昌魚個體發(fā)生談脊椎動物起源[J];海洋科學;1995年04期

8 張?zhí)焓a;動物胚胎發(fā)育講座（二）──文昌魚的胚胎發(fā)生[J];生物學通報;1994年08期

9 方永強,齊襄,梁蘋,洪桂英;廈門文昌魚性腺發(fā)育的周年變化[J];海洋學報(中文版);1990年05期

10 宋裕昌,許梅青;青島文昌魚的繁殖生物學——Ⅰ.卵巢和卵母細胞發(fā)育的觀察[J];海洋科學;1989年04期

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 布冠好,李宏基,楊國宇,汪國和;抗菌肽的作用特點及應用前景[J];動物醫(yī)學進展;2005年03期

2 崔艷紅;黃現(xiàn)青;;抗菌肽的抗菌機理及其應用[J];中國獸醫(yī)雜志;2006年09期

3 張召兄;潘曉亮;任耀軍;;抗菌肽概述及抗菌分子機理的研究進展[J];草食家畜;2006年04期

4 李明魁;郭菊;張遂平;;抗菌肽的研究與應用[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2007年01期

5 楊微;高陽;王煜;周宏璐;;抗菌肽及其在農業(yè)上應用的研究進展[J];安徽農學通報;2008年15期

6 申艮寶;栗永茂;李偉;吳光旭;;水產(chǎn)動物抗菌肽研究概況[J];安徽農業(yè)科學;2010年09期

7 李書偉;晏家友;;抗菌肽的研究進展[J];四川畜牧獸醫(yī);2010年05期

8 蔡靈;;抗菌肽來源及其應用進展[J];安徽農業(yè)科學;2013年13期

9 葉星,白俊杰;抗菌肽的研究及其在水產(chǎn)上的應用前景[J];大連水產(chǎn)學院學報;2000年04期

10 趙紅霞 ,詹勇 ,許梓榮;動物抗菌肽及其基因工程[J];江西飼料;2002年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐家萍;王成林;楊瑩;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究進展[A];華東·華中地區(qū)第十二次蠶種學術研討會論文集[C];2010年

2 孫振鈞;;蚯蚓抗菌肽研究進展[A];畜牧業(yè)環(huán)境、生態(tài)、安全生產(chǎn)與管理——2010年家畜環(huán)境與生態(tài)學術研討會論文集[C];2010年

3 尚德靜;白冰;李曉帆;付欣;鄭俊杰;;中國林蛙(Rana chensinensis)皮膚抗菌肽基因和功能多樣性研究[A];“基因、進化與生理功能多樣性”海內外學術研討會暨中國生理學會第七屆比較生理學學術會議論文摘要[C];2009年

4 黃自然;黃亞東;溫劉發(fā);鄭青;廖富頻;胡建雄;黃國慶;姜麗華;黃永彤;李運南;梁淑娃;彭中建;董加喜;夏楓耿;陳松彬;;抗菌肽生物工程及其應用[A];全國桑樹種質資源及育種和蠶桑綜合利用學術研討會論文集[C];2005年

5 廖富蘋;鐘楊生;鄧平建;黃自然;劉建軍;房師松;趙錦;;轉抗菌肽基因辣椒的表達產(chǎn)物的檢測[A];中國蠶學會第四屆青年學術研討會會議論文集[C];2004年

6 汪以真;許梓榮;;豬抗菌肽PR-39和Protegrin-1的研究進展[A];動物營養(yǎng)研究進展論文集[C];2004年

7 宋詼;鄭雯;譚明;徐健勇;梁群;張躍靈;李莉;;具有抗菌肽表達功能的地衣芽孢桿菌的構建及應用[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術研討會論文集[C];2009年

8 李偉;陳松林;張玉喜;;牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表達分析[A];湖北省遺傳學會、江西省遺傳學會2006年學術年會暨學術討論會論文摘要集[C];2006年

9 趙瑞利;韓文瑜;雷連成;韓俊友;馮新;江麗娜;孫長江;張俊敏;歐陽萍;;牛蛙皮膚抗菌肽的cDNA克隆及序列分析[A];首屆中國獸藥大會——獸醫(yī)生物制品學、獸醫(yī)微生物學學術論壇論文集（2008）[C];2008年

10 楊小蓉;朱家勇;;一個新家蠅抗菌肽基因——diptericin的克隆與生物信息學分析[A];全國寄生蟲學與熱帶醫(yī)學學術研討會論文集[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 李天舒;[N];健康報;2007年

2 李原;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

3 暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心 鄭青博士后;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

4 吳存遠　記者 朱彤;[N];科技日報;2010年

5 記者 曹繼軍 通訊員 趙如江;[N];光明日報;2001年

6 ;[N];新華每日電訊;2001年

7 張學全;[N];中國醫(yī)藥報;2001年

8 本報記者 張建列 通訊員 黃林幸;[N];廣東科技報;2013年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金莉莉;東北林蛙皮抗菌肽及其生物學特性[D];中國醫(yī)科大學;2009年

2 衣同輝;五種抗菌肽的設計、原核表達和抗菌作用機理研究[D];吉林大學;2014年

3 王利娜;雜合抗菌肽Attacin-Thanatin基因工程表達菌的構建及重組抗菌肽的生物學功效[D];四川農業(yè)大學;2009年

4 姜珊;兩種水產(chǎn)動物抗菌肽的重組表達工藝優(yōu)化與藥理藥效研究[D];中國科學院研究生院（海洋研究所）;2011年

5 牛明福;富含不同陽離子氨基酸抗菌肽的表達及其生物學活性研究[D];南京農業(yè)大學;2007年

6 孫龍;兩種鞘翅目昆蟲抗菌肽的分離純化與活性研究[D];中國林業(yè)科學研究院;2012年

7 唐文婷;基于肽—膜相互作用的模擬細胞膜法篩選抗菌肽的研究[D];江南大學;2014年

8 韓俊友;牛蛙皮膚抗菌肽分離純化、基因克隆表達及生物學特性的研究[D];吉林大學;2007年

9 鄭偉;中國鱟（Tachypleus tridentatus）基因工程抗菌肽的制備及其生物活性研究[D];吉林大學;2005年

10 喬紅偉;中國林蛙基因工程抗菌肽制備及生物學特性研究[D];吉林大學;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳鈺;人工合成抗菌肽體外抑菌作用的實驗研究[D];吉林大學;2009年

2 劇建格;高效廣譜抗菌肽產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究[D];河北農業(yè)大學;2009年

3 冉瑜;新型抗菌肽與磷脂膜的相互作用研究[D];鄭州大學;2013年

4 解棟梁;可剪切雜合抗病蛋白基因的構建及轉基因柑橘潰瘍病抗性評價[D];西南大學;2015年

5 楊雪;家蠅兩種新型抗菌肽基因muscin和domesticin的鑒定[D];河北大學;2015年

6 萬健;利用SUMO融合技術在大腸桿菌中表達抗菌肽SMAP-29及其抗菌活性研究[D];陜西理工學院;2015年

7 杜斌;探索家蠅幼蟲抗菌肽粗提物抗FBL-3細胞的濃度和作用機制[D];山西醫(yī)科大學;2015年

8 郝思怡;金環(huán)蛇抗菌肽Cath-BF在畢赤酵母中的組成型分泌表達[D];廣東藥學院;2015年

9 任璐雅;源于植物乳桿菌的抗菌肽Lac-B23基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2015年

10 呂曉萌;產(chǎn)抗菌肽乳酸菌篩選與抗菌肽異源表達[D];哈爾濱工業(yè)大學;2015年

  本文關鍵詞：文昌魚抗菌肽基因的鑒定和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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