本文選題：黃河鯉魚 + 抑制性消減雜交�。� 參考：《河南師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：生物在其生命周期中,基因按時間和空間的順序有序地進行表達,從而也決定了生命活動的多樣性和復(fù)雜性。在魚類性腺發(fā)育過程中,基因的時空表達方式也受到嚴格而精確的調(diào)控,不同的發(fā)育階段,其表達基因各不相同。通過比較卵巢不同發(fā)育時期的基因表達差異,即可能尋找到與卵巢發(fā)育密切相關(guān)的基因,因此,本文選取黃河鯉不同發(fā)育時期的卵巢進行差異基因研究。本研究從mRNA水平上,分別以未分化性腺和二期卵巢為驗證方(Tester),以成魚卵巢為驅(qū)動方(Driver),構(gòu)建抑制性消減雜交文庫;利用Sorthern斑點雜交篩選后測序得到文庫中的序列。借助GO信號通路分析其功能,從中選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的候選基因,利用實時熒光定量qRT-PCR驗證其表達。進而挑選Bmp基因進行詳細研究,結(jié)合已有的黃河鯉轉(zhuǎn)錄組文庫驗證得到Bmp家族12個基因的cDNA序列,通過qRT-PCR分析其表達情況,挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進行深入研究。借助鯉魚基因組信息對Bmp2、Bmp4和Bmp15所在染色體的基因結(jié)構(gòu)、染色體同線性分析,通過組織原位雜交和免疫組織化學(xué)染色方法對其進行時空表達定位;利用Bmp信號通路抑制劑DSM體外處理性腺,初步探究Bmp信號通路對黃河鯉性別分化和早期卵巢發(fā)育的作用。研究主要成果如下:1.成功構(gòu)建黃河鯉魚未分化性腺和二期卵巢的抑制性消減雜交文庫,經(jīng)過轉(zhuǎn)化搖菌,兩個文庫一共得到約1200個單克隆,用巢式PCR進行初步篩選,得到約600個含有插入片段的陽性克隆;之后借助Sorthern斑點雜交,進一步驗證選出差異顯著的150個克隆送公司測序。2.測序得到的序列進行生物信息學(xué)分析,在Genebank中進行Blast比對,除去重復(fù)和一些微衛(wèi)星序列,兩個庫共得到78個unigene。GO分析文庫基因的生物信號通路,分類分屬17類,其中較多基因ESTs序列分屬于蛋白質(zhì)水解作用,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化和轉(zhuǎn)化生長等。結(jié)合其基因功能分析和相關(guān)研究,選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的22個候選基因(Bmp2,Pvalb,Mid1ip1l,Pax2,Zgc,Desmin,Bmp4等)進行文庫驗證,并對其功能進行初步分析。3.選取可能參與卵巢發(fā)育的Bmp家族基因,在黃河鯉魚未分化性腺、幼魚和成魚雌雄性腺中對其表達模式定量分析,發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15分別在二期卵巢、未分化性腺和成熟卵巢中有高表達,故挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進行深入研究,驗證得出Bmp2、Bmp4和Bmp15分別為2068、2037、2165的全長序列,各編碼410、399和384個氨基酸,且羧基端均含有TGF-β結(jié)構(gòu)域。分析基因Bmp4基因在基因組骨架上有一個重復(fù)出現(xiàn),且其同線性分析染色體位置和其他物種差異較大。Bmp2和Bmp15分別位于黃河鯉第40號染色體和第5號染色體,同線性分析展示了和斑馬魚高度的進化相似性。4.原位雜交和免疫組化定位發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15三個基因表達位置相似,在二期卵巢中均集中在細胞質(zhì)中表達,成熟卵巢時期集中表達在卵泡周圍的皮質(zhì)小泡中,結(jié)合其表達量推測Bmp2是黃河鯉卵巢早期發(fā)育的重要調(diào)控基因;Bmp15基因則作為卵泡早期生長調(diào)控基因可能參與黃河鯉卵巢中卵泡大小的發(fā)育。5.黃河鯉魚未分化性腺中Bmp信號通路受到DSM成功抑制后,三個雄性標志基因(Amh,Dmrt1,Sox9a)在高濃度或者高劑量時出現(xiàn)顯著或極顯著表達上調(diào),雌性基因Cyp19和Foxl2表達量顯著降低,性腺在分子水平上出現(xiàn)偏向雄性分化的趨勢,說明Bmp信號通路對于未分化性腺向雌雄分化起重要調(diào)節(jié)作用;對二期卵巢處理后也顯示出抑制卵巢發(fā)育,故推測Bmp信號通路對于維持雌性卵巢早期正常發(fā)育有著重要的作用。綜上所述,通過構(gòu)建黃河鯉卵巢發(fā)育差異基因表達文庫,從而找到與性別分化、發(fā)育等相關(guān)的基因,對于了解黃河鯉性腺發(fā)育的進程,深入詳盡的知曉黃河鯉卵巢發(fā)育的分子機制有著非常重要的意義。同時為黃河鯉雌性發(fā)育控制機制的研究提供豐富的基因鑒定資源。
[Abstract]:In this paper , we studied the gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 in different developmental stages of the Yellow River carp . The results were as follows : 1 . The gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were studied . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were highly expressed in the ovary of the Yellow River . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 could be involved in the development of the ovarian follicles of the Yellow River .

【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：1816348