本文選題：中華絨螯蟹 + L-色氨酸��； 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis),俗稱河蟹。因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,味道鮮美,受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài),是我國(guó)的名特優(yōu)水產(chǎn)品。近年來(lái)中華絨螯蟹養(yǎng)殖朝著集約化、規(guī)�；粩喟l(fā)展,提高中華絨螯蟹的生長(zhǎng)性能、降低早熟率等一直以來(lái)就是人關(guān)注的焦點(diǎn)。色氨酸作為一種必需氨基酸,其代謝會(huì)產(chǎn)生如5-HT等多種活性物質(zhì),它們與動(dòng)物體生長(zhǎng)、發(fā)育、攝食、行為等諸多方面密切相關(guān)。研究表明飼料中添加色氨酸可提高一些動(dòng)物的生長(zhǎng)性能,提高成活率,促進(jìn)采食和降低攻擊行為等。而之前的免疫組化分析表明5-HT受體在中華絨螯蟹腸道等組織中廣泛分布,暗示了色氨酸和5-HT在中華絨螯蟹體內(nèi)有諸多生理作用;浸泡和注射實(shí)驗(yàn)表明5-HT可一定程度上促進(jìn)中華絨螯蟹的蛻殼,縮短食物在腸道內(nèi)的運(yùn)行時(shí)間。本文使用不同色氨酸含量的飼料對(duì)中華絨螯蟹進(jìn)行了30d的投喂,發(fā)現(xiàn)色氨酸飼料一方面提高中華絨螯蟹的成活率并降低斷肢率,另一方面可提高攝食量,肝胰腺中蛋白酶、脂肪酶活性也升高了,后續(xù)使用高清攝像頭攝像實(shí)驗(yàn)表明色氨酸飼料提高了中華絨螯蟹的攝食率和攝食過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。這說(shuō)明色氨酸確實(shí)對(duì)中華絨螯蟹的攝食有促進(jìn)作用,這與其他動(dòng)物的一些研究相似。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)色氨酸可以促進(jìn)中華絨螯蟹的蛻殼,為了深入研究,第三章選取調(diào)控蛻殼的主要器官—Y-器官在正常和性早熟兩種情況下進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。色氨酸的代謝產(chǎn)生的5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。其發(fā)揮作用是通過(guò)介導(dǎo)相應(yīng)的受體實(shí)現(xiàn)的,中華絨螯蟹5-HT基因克隆方面進(jìn)展緩慢,無(wú)法從分析功能等角度更深入的研究色氨酸和5-HT對(duì)中華絨螯蟹的生理作用,所以第四章利用第三章轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)5-HT1B受體基因進(jìn)行了克隆,現(xiàn)得到了3'端和5'端部分片段,并通過(guò)熒光定量的方法對(duì)5-HT1B受體在各組織和不同色氨酸飼料投喂后四種組織的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,為后續(xù)更深入的研究提供了資料。具體結(jié)果如下:1)本研究首先用不同色氨酸含量的飼料對(duì)中華絨螯蟹進(jìn)行投喂,實(shí)驗(yàn)周期為30d。旨在探討飼料中添加色氨酸對(duì)幼蟹生長(zhǎng)性能的影響。試驗(yàn)選取初始體重為2.45g左右的幼蟹360尾,隨機(jī)分成4組,每組3個(gè)重復(fù),在室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)分別投喂各自的色氨酸飼料。各組分別投喂色氨酸含量為0.36%(A,對(duì)照組)、0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)色氨酸的4種飼料。記錄實(shí)驗(yàn)前后體重、體長(zhǎng)、體寬、體高,以及斷肢和蛻殼情況,每隔7d測(cè)量各組攝食量。30d時(shí)解剖采集各組中華絨螯蟹肝胰腺用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的測(cè)定。結(jié)果表明:各組中華絨螯蟹體重、體長(zhǎng)、體寬和體高增加率以及肝體比均無(wú)顯著差異(P0.05)。D組的存活率與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05)。C組的斷肢率最低,與A組相比差異顯著(P0.05)。C組的蛻殼率和蛻殼前期的比例顯著高于A組和B組。第7d時(shí),B組和D組的攝食量顯著高于A組;第21d時(shí),D組攝食量顯著高于B組。飼料中添加色氨酸可提高中華絨螯蟹存活率、蛻殼率和攝食量,并降低斷肢率。2)隨后測(cè)量各組消化酶活性,結(jié)果表明:各試驗(yàn)組肝胰腺淀粉酶活性無(wú)顯著性差異。脂肪酶活性C組最高,顯著高于A組(P0.05),但B組和D組與A組相比無(wú)顯著性差異(P0.05)。而B組的蛋白酶活性均顯著高于A組、C組和D組(P0.05)。由此可見,飼料中添加色氨酸可提高脂肪酶活性和蛋白酶活性。3)色氨酸是5-HT和褪黑激素等生理活性物質(zhì)的前體,可以促進(jìn)動(dòng)物采食,降低日糧優(yōu)質(zhì)蛋白用量,削弱打斗行為,提高成活率。本部分旨在研究色氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹攝食過(guò)程中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和攝食率的影響,以期探索幼蟹飼料中適宜的色氨酸水平,并為色氨酸在此過(guò)程中生理調(diào)節(jié)作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)采用單因素4水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將60只體重為14.27±1.29g的1齡幼蟹隨機(jī)分成4組,每組15只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料,色氨酸水平為0.36%(A,control)。其余三組添加不同劑量的L-色氨酸,飼料中實(shí)測(cè)含量分別為:0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)。將幼蟹單只暫養(yǎng)于規(guī)格為35×25×10cm聚乙烯水箱中7d后,試驗(yàn)期間8點(diǎn)分別投喂1g左右的飼料。使用高清攝像頭記錄中華絨螯蟹在喂食1h內(nèi)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間以此計(jì)算中華絨螯蟹在攝食過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間比例;并在1h后用200目的紗網(wǎng)收集殘餌以計(jì)算攝食率;用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明:B組和C組飼料組明顯增加了中華絨螯蟹在攝食過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。此兩實(shí)驗(yàn)組蟹在攝食過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間比例分別為30.36±13.27%和32.26±14.50%,與對(duì)照組17.13±8.48%的運(yùn)動(dòng)時(shí)間相比差異顯著(P0.05),D組為24.04±11.98%與對(duì)照組間差異不顯著。本研究發(fā)現(xiàn),L-色氨酸能提高中華絨螯蟹的攝食率,其中C組和D組組攝食率分別為5.7±1.16%和5.52±1.03%,明顯高于對(duì)照組(4.46±0.68%),且兩組間存在差異顯著(P0.05)。結(jié)論:L-色氨酸參與了中華絨螯蟹攝食運(yùn)動(dòng)和攝食過(guò)程,且有促進(jìn)作用。綜合考慮,飼料中色氨酸的含量為0.75%時(shí)比較合適。4)本研究采用Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)正常與性早熟雌蟹Y-器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析,以期挖掘Y器官中差異基因的代謝通路和5-HT受體基因信息,并為探究性早熟基因水平的原因提供資料。測(cè)序分別獲得44 619538和43 052 958個(gè)clean reads,比對(duì)發(fā)現(xiàn)2655個(gè)差異表達(dá)基因,Gene Ontology(GO)功能分類分析將文庫(kù)中的差異表達(dá)基因歸類到3大功能(生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能)的42個(gè)類別中。KEGG富集分析,將文庫(kù)中的差異表達(dá)基因富集到134條特定的KEGG代謝途徑,其中4條是顯著性富集,包括酮體合成和降解、丁酸甲酯代謝、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路和堿基切除修復(fù)通路。通過(guò)RNA-seq技術(shù)獲得了豐富的中華絨螯蟹Y-器官轉(zhuǎn)錄組信息,為中華絨螯蟹新基因克隆、性早熟成因與預(yù)防和Y-器官的研究提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)�；谵D(zhuǎn)錄組分析,獲得了大量5-HT受體序列信息,比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)這些序列為1A、1B、1D、2A、2B、2C、7等類型,可作為后續(xù)RACE實(shí)驗(yàn)的核心片段。5)基于轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù),進(jìn)行了后序基因克隆的研究。獲得了5-HT1B受體的主要序列,此后分析了此基因在不同組織中的表達(dá)情況以及在色氨酸飼料投喂后其在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。根據(jù)正常與性早熟中華絨螯蟹的Y-器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)了5HT1B受體的引物:5HT1F和5HT1R擴(kuò)增得到從而得到核心片段。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),得到了中華絨鰲蟹5HT1B受體基因部分片段。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的中華絨螯蟹5HT1B受體片段長(zhǎng)為1732bp,其中開放閱讀框長(zhǎng)1080bp,編碼359個(gè)氨基酸。經(jīng)BLASTp分析顯示,中華絨螯蟹5HT1B受體片段與北黃道蟹(Cancer borealis)和美洲海螯蝦(Homarus americanus)的5-HT1B受體同源性高達(dá)96%和86%。并通過(guò)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)研究了5HT1B受體基因在中華絨螯蟹的不同組織表達(dá)情況,結(jié)果顯示上述兩者基因在肝、肌肉、卵巢、血、腸道、鰓、胸神經(jīng)、Y-器官、腦神經(jīng)和眼柄10個(gè)組織中均有表達(dá),并且均在肝胰腺中高水平表達(dá),同其他組織表達(dá)量差異顯著(P0.05)。5-HT1B受體mRNA在不同色氨酸含量飼料組的四種組織中均有表達(dá),且呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明5-HT1B可能參與了色氨酸飼料提高中華絨螯蟹生長(zhǎng)性能的過(guò)程。
[Abstract]:The study shows that tryptophan is a necessary amino acid and its metabolism can improve the growth performance of the crab , improve the survival rate , promote the eating and reduce the attack behavior . Based on the analysis of transcription group , the expression of 5HT1B receptor and the expression of 5 - HT1B receptor were analyzed . The results showed that the 5 - HT1B receptor fragment was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and rapid amplification ( RACE ) . The expression of 5 - HT1B receptor mRNA in four tissues of feed group with different tryptophan content was significantly different ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S966.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1789541