本文關鍵詞：奶牛乳樣和糞樣中幽門螺桿菌PCR檢測方法的建立及初步應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《四川農(nóng)業(yè)大學》 2015年

奶牛乳樣和糞樣中幽門螺桿菌PCR檢測方法的建立及初步應用

張于  

【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)與上消化道及胃腸道外的多系統(tǒng)疾病相關,但至今其感染人的傳染源和傳播途徑仍不明確。研究表明Hp可能是種食源性致病菌,而牛乳、羊乳是其中最可能的感染來源。目前,在幽門螺桿菌感染的眾多診斷方法中,聚合酶鏈式反應相關技術(shù)因靈敏度高,能檢出樣品中微量的Hp,而廣泛應用于各臨床樣品中Hp的檢測。本試驗分別以幽門螺桿菌16SrRNA、UreA、glmM基因為靶基因,設計特異性引物,建立奶牛乳樣和糞樣中幽門螺桿菌的PCR檢測方法,并成功應用于奶牛臨床樣品的檢測。1、Hp PCR檢測方法的建立：根據(jù)NCBI上已公布的Hp 16S rRNA、UreA、glmM基因序列,設計特異性引物。提取H. pylori動物模型適應菌株SS1株菌液(1×108 CFU/ML) DNA作為PCR模板。模板濃度、退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)等PCR反應體系及條件經(jīng)優(yōu)化后得到以下結(jié)果：25μL反應體系中,加入2μL模板DNA,16S rRNA、UreA、glmM基因分別在退火溫度為58℃～60℃、48℃～50℃、58℃～60℃時能擴增出777bp、411bp、294bp的目的條帶；其中上下游引物(10μM)各0.4μL～0.6μL,循環(huán)數(shù)為32～35個時擴增效果最好。在此條件下,16S rRNA、UreA、glmM檢測的靈敏度分別為101 CFU/ML、103 CFU/ML、103 CFU/ML。同時對比乳樣、糞樣樣品基質(zhì)條件下PCR檢測靈敏度發(fā)現(xiàn),應用UreA、glmM基因檢測人工污染的奶牛糞樣中幽門螺桿菌時,靈敏性有所下降,為104 CFU/ML。由此可得,本試驗建立的PCR方法快速、特異、靈敏、高效,為檢測奶牛攜帶幽門螺桿菌的情況奠定了基礎。2、Hp PCR檢測方法的應用：采集規(guī)模化養(yǎng)殖及散養(yǎng)的共計41頭奶牛的乳樣和糞樣進行檢測,成功檢出Hp DNA。16S rRNA、UreA、glmM于奶牛乳樣中Hp的檢出率分別為58.34%、34.15%、14.63%,而糞樣中16S rRNA、UreA、glmM檢出率分別為19.51%、12.20%及0%。16S rRNA、UreA基因檢出率明顯高于glmM。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.6
【目錄】：

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