本文關(guān)鍵詞： 犬弓首蛔蟲 卵黃原蛋白基因 克隆 表達(dá) 組織分布　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：弓首蛔蟲病(Toxocariasis)主要是由犬弓首蛔蟲(Toxocara canis,T.canis)寄生于宿主小腸而引起的一類寄生蟲病。該病具有世界性分布的特點(diǎn),有數(shù)據(jù)顯示,世界各地T.canis的感染率為0.9%~64.7%。其感染性蟲卵不僅可以感染犬,還可以感染多種動(dòng)物及人類,能引起眼睛幼蟲移行癥(Ocular larva migrans,OLM)、神經(jīng)幼蟲移行癥(Nerve larvae migration,NLM)、隱秘幼蟲移行癥(Cryptic larval migration,CLM)和內(nèi)臟幼蟲移行癥(Visceral larva migrans,VLM),導(dǎo)致嚴(yán)重的病理綜合征。因此,該病在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)上具有十分重要的意義。卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一,通常是在卵生非哺乳動(dòng)物的卵巢外組織中合成,經(jīng)卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor,Vg R)介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入卵巢,分解為卵黃蛋白(Yolk protein,YP)、卵黃脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)、卵黃高磷蛋白(Phosvitin,Pv)等功能性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),Vg不僅為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)元素,還具有促進(jìn)動(dòng)物卵母細(xì)胞的生長和分化、粒子載體、生物標(biāo)志物、抗氧化活性、免疫防御等多種生理功能。隨著秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)卵黃原蛋白基因的發(fā)現(xiàn),陸續(xù)展開了對(duì)有齒食道口線蟲(Oesophagostomum dentatum)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)、毛圓線蟲(Trichostrongylus vitrinus)等寄生蟲卵黃原蛋白的相關(guān)研究,而有關(guān)犬弓首蛔蟲Vg的研究還未見報(bào)道。本論文在實(shí)驗(yàn)室已有的T.canis轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,對(duì)犬弓首蛔蟲卵黃原蛋白(T.canis-vg,Tc-vg)基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和組織定位等相關(guān)研究。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:1.Tc-vg基因的生物信息學(xué)分析運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)Tc-vg基因進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示該基因?yàn)橐粋�(gè)完整的編碼區(qū)序列(Coding sequence,CDS),大小為5082 bp,可編碼1694個(gè)氨基酸;理論分子質(zhì)量為198 kDa,等電點(diǎn)為6.19。信號(hào)肽在線預(yù)測顯示其N端含有一個(gè)信號(hào)肽,裂解位點(diǎn)在18-19 aa處。由在線軟件分析顯示該蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上以親水性為主;含有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:Vitellogenin_N、DUF1943(domain of unknown function)以及v WD(von Willebrand factor type D domain)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲。在線分析Tc Vg磷酸化位點(diǎn)顯示該蛋白中存在三種主要的磷酸化氨基酸,即磷酸化蘇氨酸(p Thr)、磷酸化酪氨酸(p Tyr)和磷酸化絲氨酸(p Ser)共44個(gè),分別為7、19、18。亞細(xì)胞定位分析為分泌通路;功能預(yù)測顯示參與脂質(zhì)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。根據(jù)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)Tc-vg與豬蛔蟲(Ascaris suum)、美洲鉤蟲(Necator americanus)和小桿線蟲(Caenorhabditis briggsae)的相似性高達(dá)100%;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Tc-vg與A.suum(ERG83573)的親緣關(guān)系最近;與N.americanus(XP_013298422)、線蟲(Pristionchus pacificus,KKA71696)、十二指腸鉤蟲(Ancylostoma duodenale,KIH69020)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus,CDJ93502)、胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulus viviparus,KJH46366)等的親緣關(guān)系次之。2.Tc-vwd與Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域的克隆運(yùn)用PCR技術(shù),克隆獲得了Tc-vg基因的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(Tc-duf1943和Tc-vwd)。其中,Tc-vwd結(jié)構(gòu)域長度為834 bp,ORF長度為816 bp,編碼272 aa,預(yù)測蛋白分子量大小為31.15 kDa,等電點(diǎn)為5.12。犬弓首蛔蟲v WD(T.canis-v WD,TcvWD)蛋白主要參與發(fā)病機(jī)理的生物學(xué)過程。Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域長度為882 bp,ORF大小為864 bp,編碼288 aa,預(yù)測成熟蛋白分子量為33.25 kDa,等電點(diǎn)為9.57。犬弓首蛔蟲DUF1943(T.canis-DUF1943,Tc DUF1943)蛋白主要具有脂質(zhì)定位和有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)過程。3.Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)按照TaKaRa公司的質(zhì)粒提取試劑盒的說明對(duì)Tc-vwd/pMD19-T、Tc-duf1943/pMD19-T和pET28a等質(zhì)粒進(jìn)行提取,酶切之后目的基因與pET28a進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞,平板培養(yǎng)過夜,挑取單個(gè)白色菌落培養(yǎng),PCR、雙酶切及測序鑒定,將測序正確的重組質(zhì)粒Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌,挑取單菌落培養(yǎng),當(dāng)OD600值達(dá)到0.6~1.0時(shí),加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行IPTG濃度梯度和時(shí)間梯度的優(yōu)化,篩選最佳的誘導(dǎo)條件。結(jié)果顯示重組蛋白TcvWD與Tc DUF1943均以包涵體形式存在,其中TcvWD大小約為40 kDa,Tc DUF1943大小約為35 kDa;TcvWD蛋白于37°C,0.4 m M的IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高,Tc DUF1943在37°C,0.4 m M的IPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量最高。4.TcvWD多克隆抗體的制備及Western blot檢測對(duì)Tc-vwd/pET28a/BL21進(jìn)行大量表達(dá),離心收集包涵體沉淀,8 M尿素溶解,純化上清,將重組蛋白TcvWD免疫新西蘭白兔,2-3周免疫一次,共免疫四次,當(dāng)效價(jià)大于1:50000時(shí)進(jìn)行最終采血制備抗血清,對(duì)所得抗體進(jìn)行效價(jià)、濃度、純度測定。結(jié)果顯示TcvWD融合蛋白純度較高,所得抗體效價(jià)為1:512000,濃度為0.82 mg/ml,純度合格。Western blot顯示TcvWD能夠與免疫抗血清反應(yīng),而不與免疫前血清反應(yīng),即TcvWD具有良好的特異性,可用于免疫組化試驗(yàn)。5.Tc-vg特異性表達(dá)和Tc Vg免疫組織化學(xué)分析運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)方法檢測Tc-vg基因的組織差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示Tc-vg基因在犬弓首蛔蟲雌、雄蟲腸道、生殖道和體壁均有表達(dá),其中腸道表達(dá)量最高,體壁、生殖道次之。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)Tc Vg的組織分布情況進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示Tc Vg在雌蟲、雄蟲各組織中均有表達(dá),其中在腸道中高量表達(dá),在生殖道和體壁如肌肉細(xì)胞、子宮和輸精管內(nèi)有較弱表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1495690