本文關鍵詞：舞毒蛾Ⅰ型幾丁質酶β-4基序中關鍵氨基酸的活性研究　出處：《太原理工大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：舞毒蛾是世界性害蟲,可寄生于500多種植物中,會對農林業(yè)造成巨大的威脅。為了控制舞毒蛾的危害,人們嘗試了很多方法,其中生物防治法越來越受到關注。在舞毒蛾的表皮及中腸圍食膜中存在大量的幾丁質,幾丁質是昆蟲表皮及中腸圍食膜的重要組成成分,也是昆蟲防止生物危害和機械損傷的屏障。在昆蟲的生長和發(fā)育過程中,表皮和圍食膜必須定期降解與更新,其中幾丁質的生物合成和降解對昆蟲的生長發(fā)育起著至關重要的作用。昆蟲幾丁質酶是參與幾丁質降解的關鍵性酶,其中,GroupⅠ幾丁質酶因其在蛹到成蟲變態(tài)發(fā)育過程中起到不可替代的作用,被認為是潛在的綠色農藥設計靶標。舞毒蛾幾丁質酶催化區(qū)的β-4基序FDG(L/F)DLDWE(Y/F)P中一些氨基酸參與了幾丁質降解的催化過程,為了深入了解幾丁質酶的催化機制及氨基酸之間的相互影響,首先對舞毒蛾幾丁質酶中的天冬氨酸(D143,D145)及色氨酸(W146)進行了單點及多點突變,共獲得了7種突變基因(D143E,D145E,W146G,D143E/D145E,D143E/W146G,D145E/W146G,D143E/D145E/W146G)。其次將突變基因和野生基因分別構建于pFastBacTM載體中,得到表達重組體,再將重組體導入DH10B大腸桿菌中,獲得重組桿粒。最后利用轉染試劑cellfectin reagent將其轉染于Sf9細胞中,擴增病毒,用P3代病毒感染懸浮培養(yǎng)的Sf9細胞,得到了分子量約為70 kDa的高表達量的野生酶及7種突變酶。以4MU-(GlcNAc)3為底物對野生型及突變型幾丁質酶的酶學性質及動力學參數(shù)進行進行研究,實驗發(fā)現(xiàn):1.在7種突變酶中,D145E,D143E/D145E和D145E/W146G具有催化活性,而突變酶D143E,W146G,D143E/W146G及D143E/D145E/W146G則完全喪失酶學活性。2.舞毒蛾野生型與突變型幾丁質酶的最適pH及pH穩(wěn)定性均為6.0,最適溫度為50oC,在30-40oC穩(wěn)定性較好。但與野生酶相比,突變酶最適p H及最適溫度的活性范圍均明顯拓寬,且一些酶的熱穩(wěn)定性有所提高,說明突變酶具有更好的生產應用范圍及經(jīng)濟價值。3.與突變酶相比,野生酶具有最高的kcat/Km值,但突變酶卻比野生酶具有更小的Km值,說明突變后舞毒蛾幾丁質酶對底物的選擇性有所降低,但親和力變強了。通過對舞毒蛾幾丁質酶的定點突變,可以更系統(tǒng)的了解催化區(qū)重要氨基酸的作用以及它們間的相互影響,為綠色農藥設計靶標提供理論支持。同時,幾丁質的水解產物N-乙酰葡萄糖胺在醫(yī)療,食品及化工中均有廣泛的應用,在酶解法水解幾丁質生產N-乙酰葡萄糖胺中,突變酶與野生酶相比,具有更好的應用范圍及經(jīng)濟價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：太原理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ453

【參考文獻】

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