本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建

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【摘要】：西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)屬黃病毒科,黃病毒屬,是一種重要的人獸共患傳染病病毒。多種鳥類和哺乳動物對該病毒易感,其中馬受WNV的危害最為嚴(yán)重。人感染該病毒后可導(dǎo)致西尼羅熱,嚴(yán)重者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,甚至可致死亡。該病毒對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都構(gòu)成了巨大威脅。WNV尚無特異性的治療方法,疫苗免疫接種是控制該病的主要措施。目前國外已經(jīng)報道了幾種獸用WNV疫苗,我國尚且沒有可用的WNV疫苗。傳統(tǒng)減毒活疫苗和滅活疫苗免疫原性比較好,但仍存在缺陷,如滅活苗免產(chǎn)生疫應(yīng)答較慢,只能誘導(dǎo)低水平體液免疫,弱毒疫苗具有有潛在性安全問題等,因此研究者們致力于研發(fā)更為安全有效的新型疫苗。研究表明WNV prM-E蛋白能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá),并自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。該病毒樣顆粒與天然的病毒顆粒在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答方面有著相似的能力。本實驗室在之前的研究中已經(jīng)利用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了流行性乙型腦炎病毒(JEV)病毒樣顆粒。因此,本實驗擬構(gòu)建一個能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV VLPs的真核細(xì)胞系,為后續(xù)制備WNV亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。為鑒定細(xì)胞系表達(dá)目的蛋白情況,本實驗制備并篩選了一株WNV prM蛋白特異性單克隆抗體。該單抗細(xì)胞上清和腹水ELISA效價分別為1:2048和1:409600以上;單抗亞型鑒定結(jié)果表明10F7屬于IgG2a,其輕鏈類型為κ鏈;Western blot和IPMA結(jié)果顯示,該單抗與WNV prM特異性反應(yīng),與JEV無交叉反應(yīng)。將編碼WNV prM蛋白和E蛋白基因的重組質(zhì)粒pCAG-opti-WNV-prME轉(zhuǎn)染進(jìn)BHK-21細(xì)胞,然后用含有G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),經(jīng)多次亞克隆并結(jié)合間接免疫熒光(IFA)和抗原捕獲ELISA方法篩選,最終得到一個能夠穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的細(xì)胞系W-92。IFA和流式細(xì)胞術(shù)試驗結(jié)果表明該細(xì)胞系持續(xù)到第30代仍然保持高水平的蛋白表達(dá)。對W-92細(xì)胞系表達(dá)產(chǎn)物分離純化后電鏡觀察,結(jié)果表明prM蛋白可與E蛋白組裝成病毒樣顆粒。將該病毒樣顆粒抗原免疫小鼠后,可檢測到較高效價的ELISA抗體;誘導(dǎo)的抗體具有病毒中和作用,對WNV的中和抗體效價為1:40,對JEV的中和效價介于1:20~1:80,有一定程度的交叉保護(hù)作用。將純化后的VLPs免疫鵝后,其血清的JEV中和效價介:1:20~1:40之間。在使用JEV病毒P3株對小鼠致死性病毒攻擊試驗中,免疫小鼠保護(hù)率為50%-70%。本實驗構(gòu)建了一株能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的真核細(xì)胞系,為WNV亞單位疫苗的制備及診斷方法的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1296312