本文關(guān)鍵詞：抗中蜂囊狀幼蟲病毒VP2蛋白卵黃抗體制備及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：目的利用生物信息學(xué)軟件對(duì)編碼中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)結(jié)構(gòu)蛋白VP2的密碼子進(jìn)行優(yōu)化和原核表達(dá),并用其制備卵黃抗體。同時(shí)利用純化VP2蛋白作為包被抗原建立檢測(cè)抗CSBV卵黃抗體的間接ELISA方法。方法通過對(duì)17株囊狀幼蟲病毒(SBV)和7株中蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV)的VP2基因序列進(jìn)行比對(duì),選取代表毒株(Gen Bank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作為參考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相對(duì)較強(qiáng)的氨基酸替換CSBV-LN株VP2對(duì)應(yīng)位置的氨基酸,通過在線軟件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)對(duì)其密碼子進(jìn)行優(yōu)化,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-opti VP2,并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westren blot鑒定正確后,將純化的表達(dá)蛋白免疫白來杭母雞,檢測(cè)免疫雞的抗體水平和淋巴細(xì)胞增值指數(shù)進(jìn)行,分析CSBV VP2蛋白的免疫原性,同時(shí)收集免疫后雞蛋制備卵黃抗體,經(jīng)純化卵黃抗體與CSBV相互作用1 h后,接種于2-3日齡中華蜜蜂幼蟲,觀察幼蟲死亡率,研究卵黃抗體中和CSBV病毒能力。為了對(duì)制備的抗CSBV VP2卵黃抗體進(jìn)行檢測(cè),本研究以純化的VP2蛋白作為包被抗原,并通過對(duì)包被抗原濃度、卵黃抗體稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)、陰陽(yáng)性臨界值的確定以及敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn),建立檢測(cè)抗CSBV卵黃抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果17株SBV分離株遺傳進(jìn)化分析表明,SBV形成兩個(gè)分支,其中感染西方蜜蜂(Apis mellifera L)的SBV形成一個(gè)分支,而包括7株CSBV在內(nèi)的感染東方蜜蜂(Apis cerana F')的SBV形成另一個(gè)分支。7株CSBV的VP2氨基酸序列比對(duì)分析表明,不同毒株間氨基酸同源性介于94%-99.6%,其中CSBV-LN株(Gen Bank:HM237361)與各株間同源性相對(duì)較高(94.4%-99.6%),因此選擇CSBV-LN株的VP2基因序列為參考序列,同時(shí)用在CSBV所有毒株中保守性相對(duì)較強(qiáng)的氨基酸替換CSBV-LN株VP2對(duì)應(yīng)位置的氨基酸,將CSBV-LN株VP2上的第49、84和148位上的天冬酰胺(N)、組氨酸(H)和纈氨酸(V)分別替換為絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和異亮氨酸(I),進(jìn)行密碼子優(yōu)化和原核表達(dá)。優(yōu)化后的opti VP2能夠在大腸桿菌中高效表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物接種白來杭母雞可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性抗CSBV抗體,且抗體水平明顯高于PBS組(P0.05);脾淋巴細(xì)胞增值指數(shù)的測(cè)定結(jié)果顯示VP2蛋白免疫組與純化病毒免疫組的SI值差異不顯著(P0.05),但與PBS組差異顯著(P0.05);中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,病毒接種量在小于等于1x107拷貝/只時(shí)制備的抗CSBV VP2卵黃抗體組和非免疫雞蛋提取的卵黃抗體組幼蟲死亡率差異顯著(P0.05),而與PBS組差異不顯著(P0.05)。同時(shí)確定ELISA方法抗原最適包被濃度為800 ng/孔,卵黃抗體的最佳稀釋度為1:100,酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:1000。在此基礎(chǔ)上,確定該ELISA方法陰陽(yáng)性臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)為1.2661,并表現(xiàn)出良好的敏感性和重復(fù)性。結(jié)論1、通過對(duì)密碼子的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了CSBV結(jié)構(gòu)蛋白VP2在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)。2、雞免疫實(shí)驗(yàn)表明VP2蛋白具有良好免疫原性,而且用其制備的卵黃抗體,具有中和CSBV能力,為進(jìn)一步開發(fā)防治CSBV的生物制劑奠定了基礎(chǔ)。3、利用純化CSBV VP2蛋白作為包被抗原建立了抗CSBV卵黃抗體間接ELISA檢測(cè)方法。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S895

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