本文關鍵詞：miR-432-5p在徐淮山羊不同組織中的表達分析及功能研究

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【摘要】：micro RNAs(miRNAs)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA,長度約為21~25nt,其本身不編碼蛋白,但可以通過靶向抑制或降解mRNA的表達來調節(jié)生命活動。miRNA在生物體內廣泛分布,可以調控骨骼肌的增殖和分化。實驗室前期山羊骨骼肌轉錄組測序結果表明,miR-432-5p在山羊骨骼肌中表達豐度較高,推測其可能對骨骼肌的生長發(fā)育有調控作用。因此本實驗選取miR-432-5p為研究對象,深入探究其對骨骼肌生長發(fā)育的影響,對miR-432-5p在徐淮山羊胎羊和成年羊2個發(fā)育時期,不同組織中的表達譜進行分析;構建miR-432-5p的過表達載體pcDNA3.1(+)-miR-432-5p,將miR-432-5p過表達載體、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)分別轉染到C2C12細胞中,利用RT-qPCR和Western blot技術檢測細胞增殖標志基因和分化標志基因的表達量,探究miR-432-5p對C2C12細胞增殖和分化的影響;使用預測軟件預測miR-432-5p的靶基因,從中篩選出4個,構建雙熒光素酶報告基因載體來驗證其與miR-432-5p的靶向關系。本實驗主要結果如下:1.miR-432-5p在徐淮山羊不同發(fā)育時期、不同組織的表達譜分析分析miR-432-5p在徐淮山羊不同發(fā)育時期、不同組織中相對表達量可知,在胎羊個體中,miR-432-5p在腿肌中的相對表達量最高,其次是背最長肌;而在成年羊個體中,心肌和腿肌是表達量最高的兩個組織;并且miR-432-5p在胎羊肌肉組織中的表達量顯著高于成年羊。表明miR-432-5p的表達不僅具有組織差異性,還有明顯的發(fā)育時期差異性。2.pcDNA3.1(+)-miR-432-5p的構建與驗證擴增miR-432-5p前體序列,利用雙酶切法將其連接到質粒pcDNA3.1上,將構建好的過表達載體轉染293T細胞,利用RT-qPCR技術檢測miR-432-5p的相對表達量,與對照組相比,實驗組中miR-432-5p的表達量顯著上調。結果表明,pcDNA3.1(+)-miR-432-5p載體可以在細胞中高效表達,可用于后續(xù)實驗。3.miR-432-5p促進C2C12細胞增殖RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),在正常生長狀態(tài)下,miR-432-5p和Ki67的表達量是隨著細胞增殖逐步上升的,推測miR-432-5p對C2C12細胞增殖有促進作用。為了驗證這一推論,本實驗將pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors、anti-negative control(Anti-NC)分別轉染到C2C12細胞中。結果發(fā)現(xiàn),過表達miR-432-5p后Ki67 mRNA和蛋白質的表達都顯著上升,表明miR-432-5p促進了Ki67基因的表達;轉染miR-432-5p inhibitors抑制內源性miR-432-5p的表達后發(fā)現(xiàn),細胞增殖標志基因的K i67的表達量顯著下調,表明miR-432-5p可以促進C2C12細胞增殖。4.miR-432-5p抑制C2C12細胞分化將pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)轉染到C2C12細胞中,用含2%馬血清培養(yǎng)基誘導C2C12分化,用顯微鏡觀察不同處理情況下細胞生長狀態(tài)和形態(tài)的變化,提取細胞RNA和總蛋白,分別采用熒光定量PCR和Western blot檢測細胞分化標志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白質的表達量。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)第4 d,C2C12細胞有明顯的肌管形成;熒光定量PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),過表達miR-432-5p后細胞中分化標志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白質的表達量顯著下調。而轉染了miR-432-5p inhibitors后,MyoG、Myf5和Mef2c的表達量顯著上升,表明miR-432-5p抑制C2C12細胞分化。5.miR-432-5p靶基因預測及驗證利用在線預測軟件Targetscan預測miR-432-5p靶基因,由于數(shù)據(jù)庫中還沒有山羊的序列,所以用近源物種牛的mRNA:miRNA互作關系進行預測,再對預測得到的候選基因用DAVID在線軟件進行基因注釋,篩選可能對肌肉細胞增殖發(fā)育有影響的基因作為進一步研究對象。初步篩選了4個靶基因:SORT1、TGFBR2、GJC1、BCL2。構建這4個潛在靶基因的野生型和突變型雙熒光素酶報告基因載體,分別與miR-432-5p mimics共轉染到293T細胞中,根據(jù)熒光值的變化,鑒定SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。為了進一步驗證SORT1、TGFBR2基因miR-432-5p的靶向關系,將miR-432-5p mimics、negative control(NC)分別轉染至C2C12細胞中,western blot結果同樣表明SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。
【學位授予單位】：江蘇師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S827;Q78

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本文編號：1266596