發(fā)布時間：2017-12-08 07:17

  本文關(guān)鍵詞：MDC細胞蛋白雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

  更多相關(guān)文章： MDCK 宿主蛋白 多克隆抗體 雙抗體夾心ELISA

【摘要】：MDCK細胞(Madin-Darby canine kidney cells)是從一只正常成年可卡犬的腎臟中分離出來的貼壁型細胞。MDCK細胞對腺病毒、犬細小病毒、呼腸孤病毒、禽流感病毒等多種病毒都比較敏感,而且細胞容易大規(guī)模培養(yǎng),增殖快,流感病毒感染效率高,可產(chǎn)生高滴度,所以MDCK細胞被納入生產(chǎn)甲型流感疫苗和乙型流感疫苗的細胞系之一。疫苗中殘留的宿主細胞蛋白會對機體產(chǎn)生毒害作用,可能會引起過敏反應(yīng)。為了保證疫苗產(chǎn)品的安全有效,中國藥典限定了宿主細胞蛋白的殘留量,本研究對疫苗中殘留的MDCK細胞蛋白檢測方法進行了初步的探索。先用MDCK細胞制備了蛋白含量為5.03mg/mL的MDCK細胞蛋白抗原,選用低劑量抗原短程免疫法免疫家兔、豚鼠、雞和羊四種動物,獲得多克隆抗體。由于豚鼠血和雞血中MDCK抗體水平均過低,所以選用兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗體進行雙抗體夾心ELISA方法的建立。然后用間接ELISA方法測定制備的抗體效價,兔血中MDCK抗體水平為1:10000;羊血中MDCK抗體水平為1:1000。雙向瓊脂免疫擴散實驗測定制備的兔抗MDCK多克隆抗體效價為1:32,羊抗MDCK多克隆抗體效價為1:8。經(jīng)western blot分析,制備的兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗體與胎牛血清、新生牛血清、馬血清均沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng),本試驗制備獲得的多克隆抗體具有良好的特異性。用純化的羊抗MDCK多克隆抗體作為包被抗體,用改良過碘酸鈉法標記的兔抗MDCK多克隆抗體作為酶標抗體,建立檢測MDCK細胞蛋白雙抗體夾心ELISA方法,經(jīng)過對各反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終得到最優(yōu)條件:羊抗MDCK抗體最佳包被濃度為1Oμg/mL,含10%馬血清的PBST液為最佳封閉液,酶標兔抗MDCK抗體最佳稀釋度為1:2000。MDCK細胞蛋白含量在2.5-40μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,最低檢測值為2.5μg/mL。對該方法的質(zhì)量評價驗證結(jié)果表明,建立的雙抗體夾心ELISA方法特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性好。用建立的雙抗體夾心ELISA方法對基于MDCK細胞生產(chǎn)的重組禽流感病毒三價滅活疫苗(細胞源,Re-6株+Re-7株+Re-8株)進行檢測,均能檢出殘留蛋白。目前,《中國藥典》還未有關(guān)于疫苗中MDCK細胞蛋白殘留量的相關(guān)規(guī)定,本研究建立的雙抗體夾心ELISA定量檢測方法,為基于MDCK細胞生產(chǎn)人用及獸用疫苗過程監(jiān)測及產(chǎn)品檢測奠定了基礎(chǔ),為提高疫苗的質(zhì)量,降低市場風(fēng)險提供了保障。
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張紹學(xué);柴家前;常衛(wèi)山;唐珂心;徐�；�;牛鐘相;;單克隆和多克隆雙抗體夾心斑點酶聯(lián)法檢測兔瘟病毒的研究[J];中國畜禽傳染病;1993年02期

2 謝星星;李銀;李祥瑞;趙冬敏;黃欣梅;韓凱凱;劉玉卓;;檢測坦布蘇病毒的雙抗體夾心ELISA方法建立及初步應(yīng)用[J];畜牧與獸醫(yī);2014年05期

3 張琳琳;連科迅;張英;蔣燁;姜艷萍;崔文;喬薪瑗;唐麗杰;李一經(jīng);劉敏;;傳染性胰壞死病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J];淡水漁業(yè);2014年04期

4 王新平，任文陟，朱維正，李佑民，，宣華，常國權(quán)，丁壯;雙抗體夾心ELISA檢測牛病毒性腹瀉病毒的研究[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;1995年03期

5 王肖yN;蘇倩倩;李恩擴;胡敬東;;雞白細胞介素18雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年01期

6 梅建軍;王興龍;李曉燕;劉鍇;任林柱;賈劍鋒;張琴;;羊布魯菌雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及驗證[J];中國生物制品學(xué)雜志;2009年08期

7 趙廣英;梅全林;趙淑琴;王金生;;用PPA—ELISA雙抗體夾心間接法對新城疫病毒檢出的研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);1992年02期

8 高存福,秦建華,趙月蘭,包永占,張寧;牛病毒性腹瀉病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J];中國獸醫(yī)科技;2005年08期

9 孫敏;魏強;梁成珠;佟巍;叢U

本文編號：1265511