發(fā)布時間：2017-12-07 01:26

  本文關(guān)鍵詞：基于丹參KSL基因“產(chǎn)地趨向變異”規(guī)律初步解析丹參道地性遺傳特征

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【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)是中醫(yī)臨床常用的中藥材,其質(zhì)量問題一直是近些年來的研究熱點(diǎn)。因此闡明丹參的道地性是質(zhì)量問題研究的核心內(nèi)容。而要解決道地性問題,解析丹參道地性遺傳機(jī)制則是關(guān)鍵。丹參酮類成分是丹參的重要活性成分,它產(chǎn)生的機(jī)制具有很重要的研究意義。作為丹參酮類成分合成途徑下游的關(guān)鍵酶-丹參類貝殼杉烯合酶(SmKSL)將對丹參藥材有效成分的含量產(chǎn)生直接的影響。研究發(fā)現(xiàn)丹參類貝殼杉烯合酶(SmKSL)基因具有明顯的"產(chǎn)地趨向變異"(GVT)特征,并以此關(guān)鍵基因作為模板,克隆了不同產(chǎn)地丹參的SmKSL基因,測序,分析基因序列及其編碼的蛋白的序列的變異位點(diǎn),并構(gòu)建了原核表達(dá)載體,進(jìn)行體外誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),進(jìn)而進(jìn)行體外的酶促反應(yīng),酶促反應(yīng)的產(chǎn)物運(yùn)用GC-MS技術(shù)進(jìn)行分析檢測。通過產(chǎn)物峰強(qiáng)度比較酶的催化效能,從而解析丹參功能基因的GVT規(guī)律對關(guān)鍵酶生物合成功能的影響,從而探究丹參道地性的遺傳特征。具體研究成果如下:1、成功克隆SmKSL基因全長,并發(fā)現(xiàn)其具有"產(chǎn)地趨向變異"規(guī)律克隆得到的SmKSL基因全長為1788bp,理論上表達(dá)蛋白的分子量是68千道爾頓,該SmKSL蛋白具有一定的親水性,且結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。我們通過序列的比對發(fā)現(xiàn),丹參貝殼杉烯合酶具有7個可供分析的產(chǎn)地趨向變異位點(diǎn),分別位于 246bp,669bp,709bp,1047bp,1048bp,1356bp,1491bp 處,其中有非同義突變2處,同義突變有4處。河北、內(nèi)蒙、山東、四川、山西居群存在產(chǎn)地特化變異類型。并且不同產(chǎn)地丹參居群"產(chǎn)地趨向變異"的突變位點(diǎn)出現(xiàn)了較多的"非同義突變"。其中山西居群、湖北居群的SmKSL基因在349bp處的產(chǎn)地趨向變異位點(diǎn)導(dǎo)致異亮氨酸"I"突變?yōu)槔i氨酸"V",河南居群255bp處產(chǎn)地趨向變異位點(diǎn)導(dǎo)致精氨酸"R"變半胱氨酸"C"。2、構(gòu)建pET-SmKSL原核表達(dá)載體本課題成功的構(gòu)建了 SmKSL原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度為20℃,誘導(dǎo)時間是12小時,IPTG濃度為1.0 mM,A600為1.0,經(jīng)不同濃度咪唑洗脫后,確定最佳洗脫濃度為30mM咪唑,經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序驗(yàn)證,證明原核表達(dá)體系成功建立。3、SmCPS蛋白的表達(dá)根據(jù)首都醫(yī)科大學(xué)高偉教授提供的SmCPS菌株,并按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)溫度為20℃,誘導(dǎo)時間為10小時,IPTG濃度為0.4mM,OD600為0.8,SmCPS具有較大的表達(dá)量。4、成功驗(yàn)證了 SmKSL基因的功能及不同產(chǎn)地基因型對催化效率的影響對SmKSL進(jìn)行功能驗(yàn)證的催化反應(yīng)是通過以GGPP作為反應(yīng)底物,經(jīng)SmCPS酶催化所產(chǎn)生的產(chǎn)物-CPP來作為下一步催化反應(yīng)的底物,然后加入SmKSL酶進(jìn)行催化。結(jié)果證明SmKSL具有催化柯巴基焦磷酸(CPP)得到二萜烯類產(chǎn)物次丹參酮二烯的功能。山西產(chǎn)丹參的催化效能是最高的,催化效能由高至低依次為HUB、SD、SC、HN、NM、HB。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)SmKSL具有產(chǎn)地趨向變異現(xiàn)象,它的催化效能結(jié)果間接顯示了各個產(chǎn)地催化效能的高低,從一定程度上印證了丹參的道地性。因此,本課題可以為丹參的道地性提供一種合理的解釋,并闡明其遺傳機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S567.53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1260698