發(fā)布時間：2017-10-26 15:10

  本文關鍵詞：對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達研究

  更多相關文章： 白斑綜合征病毒 細胞穿膜肽 VP28 VP26 分泌表達 畢赤酵母

【摘要】：白斑綜合征病毒(WSSV)是危害全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的病原體之一,給對蝦養(yǎng)殖帶來了巨大危害。雖然目前還沒有有效地控制該病毒蔓延的方法,但是隨著wssv基因組測序的完成,該病毒結構基因的組成與功能越來越清晰,這為研究病毒侵染對蝦細胞的機制奠定了基礎。在研究病毒侵染對蝦機制的過程中,研究者們發(fā)現病毒的某些囊膜蛋白在啟動病毒感染的發(fā)生或介導病毒的侵入方面起著重要作用,其中VP28和VP26就是兩種非常重要的病毒囊膜蛋白。越來越多的研究表明將一些重要的病毒囊膜蛋白導入對蝦體內后,能夠增強對蝦抗WSSV侵染的能力,而這一研究結果促進了wssv蛋白質亞單位疫苗的誕生。然而蛋白亞單位疫苗的本質是蛋白質,在通過口服的方式免疫對蝦時,由于無法以蛋白質大分子的形式被吸收,而達不到很好的免疫效果,因此需要尋求能夠攜帶大分子貨物穿越細胞膜的載體—細胞穿膜肽(CPPs)的幫助。本研究首先利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達了CPPs-GFP的融合蛋白,所選用的CPPs分別是TAT、R9和Penetratin,并證明CPPs可以攜帶蛋白質GFP(綠色熒光蛋白)活體穿過克氏原螯蝦的腸系膜進入到蝦體的血液循環(huán)中,然后到達各個組織。在此基礎上,再次利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功分泌性表達了VP28和VP26與CPPs的融合蛋白,為WSSV蛋白質亞單位疫苗規(guī)�；a提供了基礎數據。具體研究內容與結果如下：1.TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在畢赤酵母中成功分泌性表達。首先,提取pTracer-CMV2質粒作為擴增GFP基因的模板,并且根據TAT、 R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool軟件設計了適合在酵母中表達的核酸序列,通過引物懸掛法將這些核酸序列添加到了GFP基因的5’端。選擇表達載體pGAPZαA的EcoRI和XbaⅠ雙限制性內切酶酶切位點,因此在目的基因的兩端也分別添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后,將酶切后的目的基因插入到表達載體中,轉化TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞,經博萊霉素(Zeocin)抗性篩選陽性克隆,通過測序后可知重組表達載體成功構建。其次,重組質粒經限制性內切酶BlnⅠ (AvrⅡ)酶切線性化之后,電擊轉化畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞,經Zeocin抗性篩選得到陽性轉化子。最后,SDS-PAGE蛋白質電泳檢測重組酵母表達上清目的蛋白的表達情況,結果表明本研究成功利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白,分子量大小約在29kDa。2.檢測CPPs攜帶蛋白質分子穿膜的效果。實驗室小規(guī)模發(fā)酵獲得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白,經冷凍干燥后獲得蛋白上清冷凍干粉,接著用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯蝦作為實驗動物,活體灌喂等體積等濃度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液,同時灌喂等體積的PBS作為陰性對照。灌喂兩小時后分別取樣鰲蝦的中腸、心臟和肌肉組織進行冷凍切片分析,利用熒光倒置顯微鏡可以觀察到,灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液組的鰲蝦的腸道、心臟和肌肉可以看到明顯的熒光,而灌喂GFP蛋白液的鰲蝦僅在腸道中看到微弱的熒光,陰性對照沒有觀察到任何熒光。3.VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在畢赤酵母中組成型分泌表達。根據Genbank中WSSV的基因序列設計引物,以WSSV粗提液為模板進行普通PCR擴增,得到VP28和VP26基因。同樣用引物懸掛法將TAT和R9的核酸序列添加到VP28、VP26和GFP基因的3’端,并且添加EcoRI和XbaI酶切位點。目的基因經過雙酶切、與表達載體連接、線性化、轉化畢赤酵母和篩選重組酵母這一系列分子克隆操作過程后,成功得到了重組酵母。SDS-PAGE電泳分析畢赤酵母表達上清的目的蛋白,經考馬斯亮藍R-250染色發(fā)現GFP-TAT和GFP-R9表達上清有明顯條帶,蛋白分子量大小在29kDa左右,但是沒有檢測到VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9重組蛋白的存在。隨后,采用更靈敏的蛋白質檢測方法—蛋白質銀染法,結果發(fā)現VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9表達上清組有明顯的條帶,證明VP28和VP26及其與TAT和R9的融合蛋白在畢赤酵母中成功表達,蛋白分子量大小約為32kDa。
【關鍵詞】：白斑綜合征病毒 細胞穿膜肽 VP28 VP26 分泌表達 畢赤酵母
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S945.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 引言15-17
• 第一章 文獻綜述17-28
• 第一節(jié) WSSV疫苗研究進展17-22
• 1 前言17-18
• 2 對蝦白斑綜合征病毒的結構蛋白18-19
• 3 DNA疫苗19-20
• 4 蛋白質亞單位疫苗20-21
• 5 總結21-22
• 第二節(jié) 細胞穿膜肽的研究進展22-26
• 1 前言22-23
• 2 細胞穿膜肽的結構特點23-24
• 3 細胞穿膜肽的穿膜機制24-26
• 4 細胞穿膜肽的應用26
• 第三節(jié) 本實驗的研究目的和意義26-28
• 1 研究目的26-27
• 2 研究意義27-28
• 第二章 克氏原螯蝦口服畢赤酵母表達的三種穿膜肽與GFP的融合蛋白穿腸膜效果的比較28-65
• 第一節(jié) 表達載體的構建29-45
• 1 材料和方法29-39
• 1.1 材料29-31
• 1.1.1 實驗儀器29
• 1.1.2 實驗試劑29-31
• 1.1.3 引物設計31
• 1.2 實驗方法31-39
• 1.2.1 GFP基因的克隆31-33
• 1.2.2 TAT-GFP、R9-GFP和Pentratin-GFP目的片段的獲得33-35
• 1.2.3 目的基因的連接及轉化35-36
• 1.2.4 目的基因俊落PCR鑒定及測序36-37
• 1.2.5 CPPs-GFP質粒和pGAPZaA表達質粒的提取37
• 1.2.6 質粒DNA的雙酶切及切膠回收37-38
• 1.2.7 pGAPZaA-目的基因表達載體的構建38
• 1.2.8 重組表達質粒轉化大腸桿菌Top1038
• 1.2.9 重組質粒的菌落PCR鑒定38-39
• 2 實驗結果39-44
• 2.1 目的基因的PCR擴增39-42
• 2.1.1 GFP基因的獲得39-40
• 2.1.2 TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP基因的獲得40-41
• 2.1.3 目的基因菌落PCR鑒定41-42
• 2.2 重組表達質粒載體構建與PCR鑒定42-44
• 2.2.1 目的基因質粒雙酶切結果42
• 2.2.2 重組質粒PCR鑒定42-44
• 2.2.3 重組質粒DNA測序44
• 3 小結44-45
• 第二節(jié) 目的基因在畢赤酵母中的分泌表達及穿膜效果初步研究45-65
• 1 材料與方法45-55
• 1.1 材料45-47
• 1.1.1 實驗動物45
• 1.1.2 實驗儀器45
• 1.1.3 實驗試劑45-47
• 1.1.4 引物設計47
• 1.2 實驗方法47-55
• 1.2.1 重組質粒的大量提取47-48
• 1.2.2 重組質粒Bln Ⅰ酶切線性化48-49
• 1.2.3 重組質粒轉化畢赤酵母49-51
• 1.2.4 重組畢赤酵母PCR鑒定51-53
• 1.2.5 重組酵母表達產物的檢測53-54
• 1.2.6 冷凍干燥目的蛋白54-55
• 1.2.7 重組蛋白體內腸道穿膜觀察55
• 2 結果55-59
• 2.1 重組質粒在畢赤酵母分泌表達結果55-58
• 2.1.1 重組質粒Bln Ⅰ酶切線性化55-56
• 2.1.2 重組酵母PCR鑒定56-57
• 2.1.3 重組酵母發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結果57-58
• 2.2 細胞穿膜肽攜帶GFP穿膜效果58-59
• 2.2.1 GFP腸道穿膜觀察58-59
• 2.2.2 GFP心臟和肌肉穿膜結果59
• 3 小結與討論59-65
• 3.1 小結59-60
• 3.2 討論60-65
• 3.2.1 畢赤酵母的電擊轉化60
• 3.2.2 重組酵母PCR鑒定60-65
• 第三章 WSSV囊膜蛋白VP28、VP26與穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的表達65-83
• 第一節(jié) VP28和VP26表達載體的構建65-75
• 1 材料與方法65-70
• 1.1 實驗材料65-66
• 1.1.1 主要儀器65
• 1.1.2 實驗試劑65
• 1.1.3 引物65-66
• 1.2 實驗方法66-70
• 1.2.1 VP28和VP26基因的獲得66-67
• 1.2.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9目的片段的擴增67-69
• 1.2.3 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的連接及轉化69-70
• 1.2.4 菌落PCR鑒定及測序70
• 1.2.5 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9質粒提取70
• 1.2.6 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9重組表達質粒的構建70
• 2 實驗結果70-74
• 2.1 目的基因的PCR擴增70-73
• 2.1.1 VP28、VP26和GFP基因的獲得70-71
• 2.1.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的獲得71-72
• 2.1.3 菌落PCR鑒定72-73
• 2.2 重組表達質粒構建及菌落PCR鑒定73-74
• 3 小結與討論74-75
• 3.1 小結74
• 3.2 討論74-75
• 第二節(jié) VP28和VP26在畢赤酵母中分泌表達75-83
• 1 材料與方法75-77
• 1.1 材料75-76
• 1.1.1 實驗試劑75-76
• 1.1.2 實驗儀器76
• 1.2 實驗方法76-77
• 1.2.1 重組表達質粒大量提取76
• 1.2.2 表達質粒線性化76
• 1.2.3 表達質粒轉化畢赤酵母及PCR檢測76
• 1.2.4 重組酵母表達產物的檢測76-77
• 2 結果77-81
• 2.1 重組酵母PCR檢測結果77-81
• 2.1.1 重組質粒線性化77-78
• 2.1.2 重組酵母PCR鑒定結果78-79
• 2.1.3 重組酵母發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結果79-81
• 3 小結與討論81-83
• 3.1 小結81
• 3.2 討論81-83
• 第四章 全文總結與展望83-84
• 1 全文總結83
• 2 展望83-84
• 參考文獻84-91
• 致謝91-92
• 個人簡歷92
• 已發(fā)表和擬發(fā)表的論文92

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本文編號：1099208