本文關(guān)鍵詞：雞IFIT5基因的克隆、表達(dá)及其抗病毒功能研究

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【摘要】：IFIT家族是一類主要受干擾素、病毒和脂多糖誘導(dǎo)表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)基因。其編碼的蛋白可通過抑制翻譯起始,識(shí)別、結(jié)合并隱退特定類型的病毒核酸或蛋白以及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞固有的和非固有的免疫反應(yīng)等方式來抵抗病毒的入侵。然而,目前該家族基因在禽類上的研究甚少。本研究首先通過分子克隆的方法獲取了雞IFIT5基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列,并對(duì)其相關(guān)分子生物信息進(jìn)行了分析與預(yù)測(cè)。其次,采用qRT-PCR技術(shù)構(gòu)建了雞IFIT5基因的組織表達(dá)譜,并在機(jī)體和細(xì)胞水平上檢測(cè)了雞IFIT5基因?qū)Σ煌玖π鲁且卟《径局旰筒煌T導(dǎo)刺激物的免疫應(yīng)答差異。最后,在細(xì)胞水平上采用siRNA干擾和外源過表達(dá)技術(shù)初步探究了雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3對(duì)IFIT5基因的表達(dá)調(diào)控作用以及雞IFIT5基因?qū)RF-3和NF-κB信號(hào)通路的影響。取得的主要結(jié)果如下：(1)雞IFIT5基因CDS區(qū)全序列長(zhǎng)1440bp,由兩個(gè)外顯子組成,共可編碼479個(gè)氨基酸。其推導(dǎo)氨基酸序列與鳥類對(duì)應(yīng)序列的相似度均不超過70%,與哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)序列的相似度均不超過50%。(2)雞IFIT5基因在脾、心、肺、胸腺、腎和小腸組織中具有相對(duì)較高的mRNA表達(dá)豐度,在法氏囊、腦、胸肌和腿肌組織中具有相對(duì)較低的mRNA表達(dá)豐度,而在肝臟組織中幾乎不表達(dá)。(3)雞IFIT5基因在兩攻毒組雞只的胸腺和脾臟組織中的表達(dá)量變化均呈先上升后下降的趨勢(shì)且在第二天達(dá)到峰值,在Mukteswar攻毒雞只的法氏囊組織中呈先上升后下降的趨勢(shì)且在第一天達(dá)到峰值,在F48E9攻毒雞只的法氏囊組織中則呈持續(xù)上升趨勢(shì)。(4)雞IFIT5和IFN-β基因在轉(zhuǎn)染poly I:C和poly dA:dT 4 h后表達(dá)水平顯著上調(diào)。(5)雞IFIT5和IFN-P基因在感染Mukteswar毒株后存在明顯協(xié)同表達(dá)關(guān)系,且在8h后的二次感染過程中雞IFIT5基因的表達(dá)量相對(duì)于IFN-β基因呈現(xiàn)出明顯的延后上調(diào)。(6)過表達(dá)雞MDA、MAVS和IRF-3基因可顯著增強(qiáng)雞IFIT5基因的免疫應(yīng)答水平,而干擾雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因可顯著抑制雞IFIT5基因的免疫應(yīng)答水平。(7)過表達(dá)雞IFIT5基因可顯著增強(qiáng)IRF-3和NF-κB應(yīng)答基因的免疫應(yīng)答水平。上述結(jié)果表明：雞IFIT5基因在非刺激狀態(tài)下的表達(dá)分布具有明顯的組織特異性,在受到RNA病毒或DNA病毒刺激時(shí)表達(dá)量會(huì)明顯上調(diào),且其表達(dá)水平會(huì)受到雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3蛋白的調(diào)控。此外,雞IFIT5蛋白對(duì)IRF-3和NF-κB信號(hào)通路具有正向調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：雞 IFIT5 克隆 表達(dá) 新城疫病毒
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S831
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要符號(hào)說明9-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-27
• 1.1 IFIT家族簡(jiǎn)介12-13
• 1.2 IFIT家族基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)研究進(jìn)展13-18
• 1.2.1 IFIT家族基因結(jié)構(gòu)特征13
• 1.2.2 IFIT家族基因表達(dá)特性13-14
• 1.2.3 IFIT家族基因表達(dá)調(diào)控通路14-18
• 1.3 IFIT家族蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展18-23
• 1.3.1 IFIT家族蛋白結(jié)構(gòu)特征18-19
• 1.3.2 IFIT家族蛋白功能研究19-23
• 1.4 IFIT5的研究進(jìn)展23-26
• 1.5 研究目的及意義26-27
• 2 材料與方法27-40
• 2.1 試驗(yàn)材料27-30
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與病毒來源27
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備27-28
• 2.1.3 主要試劑及耗材28-29
• 2.1.4 主要分析軟件及網(wǎng)站29-30
• 2.2 試驗(yàn)方法30-40
• 2.2.1 試驗(yàn)技術(shù)路線30
• 2.2.2 SPF雞的孵化、飼喂、攻毒和采樣30
• 2.2.3 cDNA模板的制備30-32
• 2.2.4 雞IFIT5基因CDS區(qū)的克隆與測(cè)序32-35
• 2.2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建35-36
• 2.2.6 細(xì)胞試驗(yàn)36-37
• 2.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR37-39
• 2.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析39-40
• 3 結(jié)果與分析40-57
• 3.1 雞IFIT5基因CDS區(qū)的克隆與測(cè)序40
• 3.2 雞IFIT5基因CDS區(qū)序列分析40-45
• 3.2.1 雞IFIT5基因CDS區(qū)核苷酸序列分析40-42
• 3.2.2 雞IFIT5基因推導(dǎo)氨基酸序列分析42-45
• 3.3 雞IFIT5基因mRNA水平的組織表達(dá)譜構(gòu)建45-46
• 3.4 雞IFIT5基因在機(jī)體中對(duì)不同毒力新城疫病毒的免疫應(yīng)答差異46-49
• 3.4.1 兩攻毒組胸腺組織中IFIT5基因的表達(dá)差異46-47
• 3.4.2 兩攻毒組脾臟組織中IFIT5基因的表達(dá)差異47
• 3.4.3 兩攻毒組法氏囊組織中IFIT5基因的表達(dá)差異47-49
• 3.5 雞IFIT5基因在雞胚成纖維細(xì)胞中對(duì)不同刺激物的免疫應(yīng)答差異49-51
• 3.5.1 Poly I：C對(duì)雞IFIT5基因的免疫誘導(dǎo)作用49
• 3.5.2 Poly dA：dT對(duì)雞IFIT5基因的免疫誘導(dǎo)作用49
• 3.5.3 新城疫病毒Mukteswar毒株對(duì)雞IFIT5基因的免疫誘導(dǎo)作用49-51
• 3.6 雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因?qū)FIT5表達(dá)水平的調(diào)控作用51-53
• 3.6.1 過表達(dá)雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因?qū)FIT5免疫應(yīng)答水平的影響51
• 3.6.2 干擾雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因表達(dá)對(duì)IFIT5免疫應(yīng)答水平的影響51-53
• 3.7 雞IFIT5蛋白的亞細(xì)胞定位53
• 3.8 過表達(dá)雞IFIT5基因?qū)RF-3和NF-κB應(yīng)答基因表達(dá)水平的影響53-57
• 4 討論57-62
• 4.1 雞IFIT5基因CDS區(qū)序列分析57
• 4.2 雞IFIT5基因的組織表達(dá)分布特點(diǎn)57-58
• 4.3 兩攻毒組中IFIT5基因的免疫應(yīng)答差異58-59
• 4.4 雞胚成纖維細(xì)胞對(duì)不同刺激物的免疫應(yīng)答差異59-60
• 4.5 雞MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3對(duì)IFIT5基因的表達(dá)調(diào)控60
• 4.6 雞IFIT5對(duì)IRF-3和NF-κB信號(hào)通路的影響60-62
• 5 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊輝林;雞IFIT5基因的克隆、表達(dá)及其抗病毒功能研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1001906