發(fā)布時間：2017-09-27 03:05

  本文關(guān)鍵詞：miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及其在結(jié)核診斷中的作用

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【摘要】：研究背景:結(jié)核感染仍是世界公共衛(wèi)生難題,據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計:2013年約有900萬新增活動型結(jié)核病人,其中高達(dá)150萬人因結(jié)核病而喪命。近年來隨著多重耐藥結(jié)核、廣泛性耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)以及HIV-TB的合并感染,更加劇了目前結(jié)核病防控的嚴(yán)峻形勢。結(jié)核病的主要致病菌為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb),其主要潛伏感染人巨噬細(xì)胞,并引起宿主細(xì)胞壞死裂解�？菇Y(jié)核免疫應(yīng)答是機(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌的重要環(huán)節(jié)。除作為Mtb的主要感染細(xì)胞,巨噬細(xì)胞同樣也是機(jī)體殺死結(jié)核分枝桿菌的重要效應(yīng)細(xì)胞。已有研究表明:細(xì)胞凋亡在機(jī)體抗結(jié)核固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,Mtb減毒株或無毒株可促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生,控制結(jié)核感染;然而Mtb強(qiáng)毒株可抑制凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死,引起結(jié)核擴(kuò)散。結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6,作為結(jié)核分枝桿菌的重要毒力因子,在免疫調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。已有研究顯示:結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡,有利于機(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌,但其相關(guān)分子機(jī)制并不十分清楚。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn):ESAT-6抗原刺激巨噬細(xì)胞后,能引起胞內(nèi)mi R-155表達(dá)顯著升高,相關(guān)研究報道m(xù)i R-155參與了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡,通過生物信息學(xué)預(yù)測分析,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)是mi R-155的一個重要靶基因,且已有證據(jù)表明SOCS1可能是Mtb感染時巨噬細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號通路的一個關(guān)鍵分子,由此,我們推測mi R-155與SOCS1相互作用可能參與了結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡過程。本研究擬在已有研究報道和我們前期工作基礎(chǔ)上開展如下工作:(1)明確結(jié)核抗原ESAT6處理巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞內(nèi)mi R-155、SOCS1的動態(tài)變化和時間特異性;(2)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染控制mi R-155及SOCS1表達(dá),探討ESAT-6處理后,巨噬細(xì)胞中凋亡分子Caspase-3表達(dá)情況,明確mi R-155及SOCS1在巨噬細(xì)胞凋亡中的作用;同時采用si RNA干擾技術(shù)控制Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)及NF-κB p65表達(dá),初步探討ESAT-6誘導(dǎo)mi R-155表達(dá)上調(diào)的原因;(3)收集人外周血單個核細(xì)胞,熒光定量PCR檢測特定免疫分子及細(xì)胞因子表達(dá)情況,探討其在結(jié)核診斷中的作用。本研究力圖為闡明ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用提供新的理論依據(jù),同時亦為尋找新的結(jié)核病干預(yù)靶點(diǎn)及臨床結(jié)核病診治提供新的思路。方法:1.應(yīng)用結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6處理巨噬細(xì)胞系RAW264.7,收集經(jīng)處理后不同時間點(diǎn)細(xì)胞總RNA及蛋白,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測胞內(nèi)mi R-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等m RNA表達(dá)水平;Western-blot技術(shù)檢測SOCS1、NF-κB p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平;同時,采用流式細(xì)胞儀檢測不同時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡發(fā)生情況;2.采用慢病毒過表達(dá)mi R-155及抑制mi R-155,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測胞內(nèi)SOCS1、IL6及TNF-αm RNA表達(dá)變化;Western-blot技術(shù)檢測SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平變化;并用流式細(xì)胞儀分析抑制mi R-155后對細(xì)胞凋亡的影響;3.采用慢病毒過表達(dá)SOCS1基因,Western-blot技術(shù)檢測凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平;同時在過表達(dá)SOCS1的條件下,Western-blot技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)觀察mi R-155對巨噬細(xì)胞凋亡的影響;4.為了進(jìn)一步弄清楚ESAT-6誘導(dǎo)mi R-155表達(dá)上調(diào)的主要原因,我們采用了si RNA干擾技術(shù),控制RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TLR2及NF-κB p65的表達(dá),并用Western-blot技術(shù)觀察TLR2及NF-κB p65干擾效果,以及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)mi R-155表達(dá)水平;5.將研究人群分為三個組:正常對照組、活動型結(jié)核組及潛伏型結(jié)核組。收集人外周血單個核細(xì)胞,提取總RNA,采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測特定免疫分子(TLR2、BIC、mi R-155、SOCS1)及細(xì)胞因子(TNFα、IL6、IL12p40、i NOS、IFN-γ)m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:1.ESAT-6處理巨噬細(xì)胞24h內(nèi),細(xì)胞凋亡分子活性Caspase-3表達(dá)不斷增加;流式細(xì)胞檢測結(jié)果亦表明ESAT-6能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生,并有時間依賴效應(yīng);此外,研究結(jié)果顯示mi R-155、BIC及相關(guān)細(xì)胞因子m RNA表達(dá)水平隨ESAT-6處理時間不斷增加,而SOCS1表達(dá)水平隨時間增加而不斷下降;2.單獨(dú)過表達(dá)mi R-155能顯著抑制SOCS1表達(dá),提高巨噬細(xì)胞凋亡分子Cleaved Caspase-3表達(dá),并促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生。采用慢病毒抑制mi R-155表達(dá),巨噬細(xì)胞內(nèi)SOCS1表達(dá)明顯升高,而細(xì)胞因子如IL6,TNF-α等表達(dá)顯著減少,細(xì)胞凋亡受到明顯抑制;3.過表達(dá)SOCS1基因可抑制ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡;而在過表達(dá)SOCS1條件下,過表達(dá)mi R-155則可恢復(fù)Cleaved Caspase-3表達(dá)及大部分巨噬細(xì)胞凋亡的發(fā)生。4.成功構(gòu)建TLR2及NF-κB p65-si RNA干擾細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制TLR2表達(dá)能顯著降低ESAT-6介導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá),并干擾細(xì)胞內(nèi)mi R-155的表達(dá),提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6誘導(dǎo)mi R-155表達(dá)上調(diào)的主要原因。5.Q-PCR檢測人外周血單個核細(xì)胞中特定免疫調(diào)節(jié)分子(TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1)和細(xì)胞因子結(jié)果表明:TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1在各組別中差異表達(dá),進(jìn)一步統(tǒng)計分析提示mi R-155/SOCS1比值可能區(qū)分活動型結(jié)核及潛伏型結(jié)核感染。結(jié)論:1.mi R-155在ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫活化及凋亡過程中具有重要作用;2.mi R-155可能通過靶向作用SOCS1參與調(diào)控結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生;3.ESAT-6誘導(dǎo)的mi R-155表達(dá)上調(diào)與巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2/NF-κB活化相關(guān);4.TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1或可作為結(jié)核病診斷的新型生物標(biāo)記分子。綜上所述,TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1信號參與了ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡過程,mi R-155在ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,這可能揭示了結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)作用中的新機(jī)制。同時,本研究提示TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1或可作為宿主免疫調(diào)節(jié)治療的重要靶標(biāo),為結(jié)核治療研究增添了新的內(nèi)容;此外,人群研究提示TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1或可作為活動型結(jié)核及潛伏型結(jié)核診斷的重要指標(biāo),為結(jié)核病的診斷可能提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：凋亡 早期分泌抗原6 微小RNA-155 核轉(zhuǎn)錄因子-κB 細(xì)胞因子信號抑制因子-1 Toll樣受體-2 結(jié)核病
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-15
• 第一章 前言15-23
• 1.1 選題緣由15-16
• 1.2 研究背景16-22
• 1.3 研究意義22-23
• 第二章 miRNA-155靶向作用SOCS1基因調(diào)控結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡23-53
• 2.1 材料與方法24-40
• 2.2 結(jié)果40-50
• 2.3 討論50-53
• 第三章 miRNA-155及SOCS1的表達(dá)在活動型結(jié)核及潛伏型結(jié)核診斷中的作用53-65
• 3.1 材料與方法54-59
• 3.2 結(jié)果59-62
• 3.3 討論62-65
• 全文總結(jié)65-66
• 本研究的創(chuàng)新之處66-67
• 參考文獻(xiàn)67-79
• 文獻(xiàn)綜述 抗結(jié)核病治療研究進(jìn)展79-105
• 參考文獻(xiàn)93-105
• 附錄105-107
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果107-108
• 致謝108

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本文編號：927248