本文關(guān)鍵詞：缺氧對人牙周膜成纖維細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：牙周炎是一類嚴(yán)重危害人類口腔健康的慢性感染性疾病,在全球有著極高的發(fā)病率,是導(dǎo)致成人牙齒松動直至缺失的首要原因,而近年來的研究表明缺氧環(huán)境能加重牙周炎病變過程,影響牙周組織的防御與修復(fù)。盡管當(dāng)前缺氧對牙周炎作用的研究取得一定進(jìn)展,但具體機(jī)制尚不明確。牙周炎的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙周組織介導(dǎo)的骨形成和骨吸收失衡,伴隨著牙周組織的的直接破壞和免疫損傷,最終導(dǎo)致牙槽骨的喪失。目前研究認(rèn)為,除了病原體的直接損傷外,牙周炎的病理損傷主要由病原體誘導(dǎo)牙周組織細(xì)胞分泌趨化因子、粘附分子、炎癥因子,異常增高的炎性介質(zhì)介導(dǎo)免疫細(xì)胞黏附移行聚集到炎癥部位,并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞(Osteoclasts,OC)前體細(xì)胞如外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)向OC分化,從而造成牙周組織的破壞、降解和吸收。人牙周膜作為牙周組織的一個(gè)重要組成成分,主要由人牙周膜成纖維細(xì)胞(Human Periodontal Ligament Fibroblasts,h PDLF)所組成。hPDLF不僅參與了牙周組織的改建和再生,同時(shí)還具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力,能與免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用。因此,h PDLF的生物學(xué)活性與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是,目前關(guān)于h PDLF在牙周炎病程中的調(diào)節(jié)作用,以及缺氧能否通過影響h PDLF的多種生物學(xué)特性,進(jìn)而加重牙周炎疾病過程仍然很不清楚。在本研究中,我們首先觀察h PDLF對不同細(xì)菌LPS產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,從而明確其在牙周組織免疫調(diào)節(jié)中的作用;其次我們觀察在常氧和缺氧環(huán)境下,h PDLF內(nèi)毒素耐受(Endotoxin Tolerance,ET)能力的變化,通過上述結(jié)果我們期望證實(shí),在牙周炎早期,缺氧通過破壞hPDLF的ET,促進(jìn)炎癥因子分泌,從而加重免疫損傷;然后,我們將h PDLF與PBMCs進(jìn)行共培養(yǎng),觀察在缺氧和常氧條件下,二者相互作用對炎癥因子分泌的影響,從而說明缺氧可以通過增強(qiáng)h PDLF與PBMCs的協(xié)同作用,進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥因子的分泌;最后,我們觀察兩種細(xì)胞在共培養(yǎng)條件下,缺氧能否影響hPDLF向成骨分化的能力,以及PBMCs向破骨分化的能力,并對缺氧調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的機(jī)制進(jìn)行初步探討,以期證明,牙周炎發(fā)生時(shí)在h PDLF與PBMCs相互作用過程中,缺氧能通過影響兩種細(xì)胞分化的能力,加重缺氧環(huán)境下牙周炎的病理損傷。在本研究中,主要分三個(gè)部分:第一,我們構(gòu)建本課題所需要的實(shí)驗(yàn)平臺,包括體外分離培養(yǎng)hpdlf和pbmcs及其鑒定;第二,我們在體外常氧和缺氧環(huán)境下分別構(gòu)建hpdlf的et模型,對其分泌的細(xì)胞因子和表達(dá)的tlrs進(jìn)行檢測;第三,構(gòu)建hpdlf和pbmcs共培養(yǎng)體系,觀察缺氧環(huán)境是否影響二者炎癥因子的分泌。同時(shí),對兩種細(xì)胞分化能力進(jìn)行檢測,并通過正反向?qū)嶒?yàn)初步探討其分化能力改變的分子機(jī)制。我們希望通過我們的研究,更好地認(rèn)識缺氧在促進(jìn)牙周炎病理損傷中的作用。一、hpdlf和pbmcs的分離培養(yǎng)及鑒定1.hpdlf的分離培養(yǎng)及鑒定:沿冠根單向刮下根中1/3的牙周膜組織,0.1%i型膠原酶消化后進(jìn)行組織塊培養(yǎng);細(xì)胞約10-14d可見大量透明纖維條索樣細(xì)胞從組織塊中爬出,細(xì)胞呈長梭形,免疫組化鑒定結(jié)果:小鼠抗人vimentin陽性,小鼠抗人cytokeratin陰性,表明hpdlf的間葉源性,而非上皮來源,結(jié)合取材部位、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和組織來源可以證明我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞即為hpdlf。2.pbmcs的分離培養(yǎng)及鑒定:采用ficoll-hypaque梯度密度離心法分離外周血細(xì)胞,經(jīng)低速離心后細(xì)胞分4層,其中第2層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞,即為pbmcs,giemsa染色對pbmcs分離純度進(jìn)行檢測。二、缺氧條件下,hpdlf的et能力降低1.常氧條件下,hpdlf的et模型構(gòu)建:分兩次加入pglps或者eclps刺激hpdlf,其中初次加入兩種細(xì)菌lps的劑量范圍從0ng/ml-1000ng/ml,而再次加入兩種lps的劑量為1000ng/ml。對細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子濃度檢測發(fā)現(xiàn):第一,兩種細(xì)菌lps初次刺激可以誘導(dǎo)6種炎癥因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α、il-10以及il-12p70)表達(dá)上調(diào),其中以il-8和il-6水平增加最為顯著;第二,兩種細(xì)菌lps再次刺激后,il-8和il-6濃度顯著下降,提示兩種lps均可以誘導(dǎo)hpdlf產(chǎn)生et。同時(shí),我們對hpdlf在接受lps刺激后,其tlr2和tlr4在mrna和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)hpdlf產(chǎn)生et后,tlr2和tlr4表達(dá)均下調(diào),這說明兩種lps再次刺激時(shí)可以通過hpdlf表達(dá)的tlr2和tlr4下調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生et。2.缺氧條件下,hpdlfet能力的變化:利用常氧條件下建立的hpdlfet平臺,我們對缺氧條件下,兩種細(xì)菌lps誘導(dǎo)hpdlf炎癥因子的分泌進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與常氧條件不同的是,雖然缺氧條件下,兩種lps初次刺激均可以誘導(dǎo)il-6和il-8濃度上調(diào),但是再次刺激后,細(xì)胞并未出現(xiàn)et現(xiàn)象。同時(shí),對再次刺激時(shí)hpdlf表達(dá)的tlr2和tlr4進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn),與初次刺激相比,兩種lps再次刺激后,兩種tlr表達(dá)量并沒有變化。這說明缺氧可以破壞hpdlf的et,保持細(xì)胞對外界病原刺激物的持續(xù)反應(yīng)性,從而維持炎癥因子的高水平分泌。三、缺氧條件下,hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)時(shí)炎癥因子分泌,以及分化能力檢測1.共培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子濃度檢測:hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)24h后,收集上清進(jìn)行炎癥因子檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在常氧和缺氧共培養(yǎng)條件下,除了il-12p70沒有檢測到分泌外,其它5種炎癥因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α以及il-10)濃度均明顯上升。其中il-8、il-6以及il-12p70常氧和缺氧條件下表達(dá)基本一致,tnf-α表達(dá)缺氧強(qiáng)于常氧,而il-1β和il-10表達(dá)常氧高于缺氧,這說明氧濃度能夠?qū)煞N細(xì)胞分泌炎癥因子的種類和濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。與pbmcs單獨(dú)培養(yǎng)相比,在缺氧和常氧培養(yǎng)條件下,tnf-α無論是兩種細(xì)胞間接共培養(yǎng)或直接共培養(yǎng),其炎癥因子分泌均呈下降趨勢,其中缺氧條件下降低更為顯著,其它細(xì)胞因子的變化則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。缺氧共培養(yǎng)是否依賴其它種類的炎性介質(zhì)增強(qiáng)免疫損傷,尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。2.兩種細(xì)胞共培養(yǎng)條件下,hpdlf向ob分化以及pbmcs向oc分化能力檢測:通過alp和trap染色,分別觀察hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)條件下,兩種細(xì)胞分化能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺氧、共培養(yǎng)時(shí)hpdlf向ob分化的能力減弱,而pbmcs向oc分化能力增強(qiáng),單一培養(yǎng)的pbmcs沒有形成典型的oc,這說明oc的形成需要兩種細(xì)胞的相互作用,牙周炎發(fā)生時(shí)在pbmcs與hpdlf相互作用過程中,缺氧可以通過抑制hpdlf向ob分化,促進(jìn)pbmcs向oc分化,從而增強(qiáng)牙周組織病理損傷。3.缺氧影響兩種細(xì)胞分化的機(jī)制探討:我們首先檢測了hpdlf中轉(zhuǎn)錄因子hif-1α和nf-κb的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在缺氧3h時(shí)hpdlf中hif-1α蛋白表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步通過抑制或增強(qiáng)hif-1α的表達(dá),我們初步探討了hif-1α在調(diào)節(jié)兩種細(xì)胞分化中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),yc-1抑制hif-1α表達(dá)后,hpdlf向ob分化受到抑制,而pbmc向oc分化能力增強(qiáng),而在hpdlf中過表達(dá)hif-α則促進(jìn)其向ob分化。這說明缺氧時(shí)hif-1α的表達(dá)起保護(hù)性作用,缺氧在調(diào)節(jié)hpdlf與pbmcs分化過程中,并不是以hif-1α依賴的方式促進(jìn)破骨分化,缺氧促進(jìn)破骨分化加重牙周組織損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。本研究成功分離培養(yǎng)hpdlf和pbmcs,并對二者進(jìn)行了鑒定;我們發(fā)現(xiàn)lps能夠調(diào)節(jié)hpdlf中tlr2和tlr4的表達(dá),誘導(dǎo)自身et的產(chǎn)生,而缺氧則可以破壞et。這提示在缺氧影響牙周炎病變的過程中,外源性病原刺激物可能直接作用于et減弱或缺失的hpdlf,從而增強(qiáng)炎癥因子分泌,加重牙周組織免疫損傷。隨后我們對hpdlf與PBMCs在缺氧條件下的相互作用進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)hPDLF向OB分化能力減弱,而PBMCs向OC分化能力增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),缺氧時(shí)雖然h PDLF的HIF-1α表達(dá)上調(diào),但并不參與這一調(diào)控過程。本研究首次證實(shí)了LPS能誘導(dǎo)hPDLF產(chǎn)生ET,并在一定程度上揭示了缺氧增強(qiáng)牙周炎損傷的機(jī)制,并進(jìn)一步認(rèn)識hPDLF的生物學(xué)特性,同時(shí)為各種病理刺激下,干預(yù)牙周炎疾病的進(jìn)展提供了新的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人牙周膜成纖維細(xì)胞 外周血單個(gè)核細(xì)胞 內(nèi)毒素耐受 缺氧
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及鑒定19-32
• 2.1 材料和方法19-26
• 2.2 結(jié)果26-28
• 2.3 討論28-32
• 第三章 缺氧對h PDLF的免疫學(xué)特性的影響及機(jī)制初探32-53
• 3.1 材料和方法32-43
• 3.2 結(jié)果43-47
• 3.3 討論47-53
• 第四章 缺氧對h PDLF與PBMCs相互作用的影響及機(jī)制初探53-79
• 4.1 材料和方法53-69
• 4.2 結(jié)果69-74
• 4.3 討論74-79
• 全文結(jié)論79-81
• 參考文獻(xiàn)81-88
• 文獻(xiàn)綜述TLRs信號通路在牙周組織中的作用88-115
• 參考文獻(xiàn)102-115
• 研究生期間發(fā)表文章115-116
• 致謝116

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1 朱辛奕;浦鐵民;李劍鋒;賈涵;萬英明;張德素;朱海宇;;正畸治療對牙周組織的影響及相關(guān)性研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

2 姜紅;姜廣水;;牙周組織發(fā)育和再生的研究進(jìn)展[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2010年03期

3 章立群;孫輝;鄧碧霞;謝安琪;;防止牙-牙周組織切片脫片技術(shù)的改進(jìn)[J];海南醫(yī)學(xué);2012年13期

4 杜鵑;范志朋;;利用干細(xì)胞及細(xì)胞因子再生牙周組織的研究進(jìn)展[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2013年02期

5 張?zhí)N惠;;老年人的牙周組織[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料.口腔醫(yī)學(xué)分冊;1974年04期

6 王昆潤;;牙周組織溫度的測定[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1988年02期

7 吳友農(nóng);應(yīng)盡量保持牙周組織的完整[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1994年02期

8 王昆潤;長期處于應(yīng)激狀態(tài)的人牙周組織的狀況[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1996年06期

9 賈曉真;血小板源性生長因子在牙周組織損傷修復(fù)中的作用[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1999年04期

10 章捍東,劉洪臣;白細(xì)胞介素-6與牙周組織的改建[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2005年06期

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1 王渝;臧光祥;孫宏晨;李成庫;;牙及牙周組織聯(lián)合石蠟切片和染色技術(shù)[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會第七屆全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2006年

2 劉樹泰;王渝;孫宏晨;張澤兵;臧光祥;李成庫;;提高鼠牙及牙周組織聯(lián)合切片質(zhì)量的特殊方法[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會第七屆全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2006年

3 劉樹泰;孫宏晨;吳哲;王渝;臧光祥;車延海;;Simvastatin抑制實(shí)驗(yàn)性牙周組織吸收的體內(nèi)研究[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會第七屆全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2006年

4 黃蕓芹;;固定修復(fù)齦邊緣與牙周組織健康[A];浙江省第十二屆農(nóng)村醫(yī)學(xué)暨鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

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7 吳淑儀;李彥;喬永剛;;咬合垂直距離升高對大鼠牙周組織的影響[A];第六次全國口腔修復(fù)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2009年

8 李瑋;朱衛(wèi)東;侯建霞;黃寶鑫;劉凱寧;孟煥新;;維生素D結(jié)合蛋白及其受體在牙和牙周組織的表達(dá)[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

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1 宋偉;牙周缺損可以再生[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2001年

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4 健康時(shí)報(bào)特約記者　 崔玉艷;學(xué)齡前兒童別用電動牙刷[N];健康時(shí)報(bào);2006年

5 佚名;牙周炎的治療[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2006年

6 健康時(shí)報(bào)特約記者　 楊貴恩;戴假牙后牙床怎么老出膿？[N];健康時(shí)報(bào);2006年

7 王建偉;拒絕“老掉牙”[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2006年

8 王建偉;拒絕“老掉牙”[N];保健時(shí)報(bào);2006年

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1 武曦;缺氧對人牙周膜成纖維細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 吳亞菲;基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑在牙周炎動物模型牙周組織中表達(dá)的研究[D];四川大學(xué);2006年

3 陳欣戩;hbFGF基因修飾的組織工程化復(fù)合物修復(fù)牙周組織缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

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5 錢虹;fibromodulin在正常牙周組織、炎性牙齦組織和牙周損傷愈合過程中的分布與表達(dá)[D];武漢大學(xué);2004年

6 于美嬌;系統(tǒng)歸巢的間充質(zhì)干細(xì)胞在牙周組織修復(fù)再生過程中的作用研究[D];山東大學(xué);2011年

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8 陳雨雪;應(yīng)用EMD進(jìn)行重建的牙周組織對正畸力的應(yīng)答及機(jī)理的研究[D];四川大學(xué);2006年

9 唐q琪;hOPG基因修飾的組織工程化復(fù)合物修復(fù)自體牙周組織缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

10 江俊;hBMP-7基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠牙周組織缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

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1 馬衛(wèi)劍;葛根芩連湯對實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠治療前后血清及牙周組織中IL-1β的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

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5 陳溶;正畸大鼠牙周組織內(nèi)胰島素樣生長因子-Ⅰ的表達(dá)[D];吉林大學(xué);2009年

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8 林敏魁;自身生長因子和自體牙周膜細(xì)胞移植修復(fù)牙周組織缺損的動物實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

9 呂琳琳;神經(jīng)因素影響大鼠牙周組織缺損愈合過程的機(jī)制探討[D];山東大學(xué);2014年

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本文編號：671318