本文關(guān)鍵詞：急性脊髓損傷的生物信息學(xué)分析及相關(guān)基因HIF-1α的表達(dá)分析

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【摘要】：研究背景：脊髓損傷(SCI)一般情況下定義為脊椎脊髓受到傷害而造成其主要功能包括運(yùn)動(dòng),感覺,自主神經(jīng)和反射等功能的完全或者部分的喪失,是臨床上一種常見的嚴(yán)重的致殘性損傷,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷的病理生理過程的研究對(duì)促進(jìn)其綜合性藥物干預(yù)措施的研究至關(guān)重要。繼發(fā)于脊髓原發(fā)損傷的繼發(fā)性損傷所產(chǎn)生的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了原發(fā)性損傷,是發(fā)生于細(xì)胞和分子水平的一個(gè)主動(dòng)調(diào)節(jié)過程,是可以受調(diào)控因素影響的,所以這個(gè)過程具有可逆性且可被控制。目前對(duì)于SC1的研究主要集中在脊髓損傷后基因表達(dá)的變化方面。基因芯片(gene chip)又可以稱之為DNA微陣列(DNA microarray),這項(xiàng)技術(shù)是伴隨著人類基因組計(jì)劃而產(chǎn)生的,他是目前生命科學(xué)領(lǐng)域當(dāng)中的前沿性生物技術(shù)之一�；蛐酒@著的特點(diǎn)是它所具有的高通量、高集成、多樣化、微型化以及自動(dòng)化等相關(guān)特性。經(jīng)過最近特別是近十幾年的發(fā)展,基因芯片已經(jīng)在相關(guān)的研究中的基因表達(dá)分析、疾病的基因診斷、藥物的基因組學(xué)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用,并且在未來(lái)的相關(guān)生物研究中中具有巨大的研究和應(yīng)用前景。集合了多種mRNA表達(dá)譜的基因芯片可以篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達(dá)基因。通過篩選出的相關(guān)基因可以很方便、快速地了解和認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,為疾病診斷的確定和提供恰當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┯辛ι镝t(yī)學(xué)技術(shù)的保證。現(xiàn)在脊髓損傷的動(dòng)物模型有多種,例如球囊壓迫,擠壓,鉗夾,側(cè)切,全切,脊椎橫斷,挫傷和去除一部份脊髓組織。為更好的模擬脊髓損傷的原發(fā)和繼發(fā)的損傷過程,我們采用大鼠鉗夾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?應(yīng)用血管夾(vascular clip)損傷脊髓組織,對(duì)脊髓組織進(jìn)行擠壓但是保持硬脊膜的完整性。所建立的動(dòng)物模型具有簡(jiǎn)單、廉價(jià)并且高度可重復(fù)性。缺血(ischemia)越來(lái)越多的被認(rèn)為是急性脊髓損傷的病理生理變化的一個(gè)焦點(diǎn),它可能是引起和加重急性脊髓損傷繼發(fā)性損傷的重要原因。低氧誘導(dǎo)因子是迄今發(fā)現(xiàn)的組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下誘生的最直接或唯一的調(diào)控因子,是調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)下細(xì)胞分化和存活的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。在相關(guān)的脊髓損傷的生物信息學(xué)分析中我們發(fā)現(xiàn)HIF-1可能是脊髓損傷中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。我們通過自己建立的改良大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型,應(yīng)用RT-PCR,Western blot,原位雜交,ELISA等檢測(cè)方法,檢測(cè)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1及其靶基因VEG、EPO的表達(dá)并分析它們與脊髓損傷的相關(guān)性和相互之間的相關(guān)性。同時(shí),結(jié)合臨床檢測(cè)脊髓損傷患者外周血中的VEG、EPO的表達(dá)情況,與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比研究,探討HIF-1及其靶基因VEG, EPO在繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)生發(fā)展過程中作用,從而為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。目的：1.本實(shí)驗(yàn)的目的為使用集合了多種mRNA表達(dá)譜的基因芯片來(lái)篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達(dá)基因,及脊髓損傷后差異表達(dá)的上調(diào)基因和下調(diào)基因。2.建立一種改良大鼠脊髓損傷模型,并評(píng)價(jià)其可重復(fù)性及可操作性；3.探究低氧誘導(dǎo)因子及其靶基因在脊髓損傷后的缺氧耐受及血管新生相關(guān)的病理生理過程中的表達(dá)。方法：1.1選擇NCBI基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片數(shù)據(jù)(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).選取GSE2270基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)。1.2使用R語(yǔ)言的limma數(shù)據(jù)包,通過與相應(yīng)的對(duì)照組對(duì)比,確定脊髓損傷后的差異表達(dá)基因(DEGs)。1.3采用Cytoscape軟件及其插件對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析。1.4 使用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://www.david.niaid.nih.gov)網(wǎng)絡(luò)工具,通過超幾何分布法,對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行通路功能富集分析,計(jì)算在通路中的P值。所得數(shù)據(jù)與KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。1.5使用DiRE數(shù)據(jù)庫(kù)分析富集在細(xì)胞通路上的DEGs,尋找每一個(gè)細(xì)胞通路上的調(diào)控元件。2.采用鉗夾法建立大鼠急性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２捎蒙窠?jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)BBB評(píng)分體系評(píng)價(jià)模型的神經(jīng)功能,采用HE染色和尼氏染色評(píng)價(jià)脊髓損傷脊髓的病理變化。3.1通過RT-PCR方法檢測(cè)脊髓損傷后不同時(shí)相HIF-1α mRNA的變化。3.2原位雜交及免疫組化方法分析脊髓損傷后不同時(shí)相脊髓組織內(nèi)HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)情況。3.3采用Western blot及TU N EL染色方法分析不同時(shí)相AI F和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平,觀察脊髓內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。3.4采用ELISA方法檢測(cè)臨床脊髓損傷患者外周血內(nèi)VEGF EPO的表達(dá)情況。結(jié)果：1.通過生物信息學(xué)分析,共確定了173個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中130個(gè)上調(diào)基因,43個(gè)下調(diào)基因。這些DEGs富集于不同的GO,如損傷應(yīng)答、炎癥應(yīng)答和免疫應(yīng)答等。通過DEGs的通路富集分析,8條通路被顯著富集,如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用通路,Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路等。在每一條通路中,都有顯著的調(diào)控元件和調(diào)控因子,其中缺氧誘導(dǎo)因子、同源框蛋白BEL1是兩個(gè)含量最高的調(diào)控因子,RAC2是處于焦點(diǎn)位置的調(diào)控因子。通過分析確定了幾個(gè)關(guān)鍵基因,HIF1, BAC2, CD44, 和ARPC1B,它們都通過不同的通路參與SCI疾病的進(jìn)展。2.鉗夾大鼠急性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?實(shí)驗(yàn)組的BBB評(píng)分同對(duì)照組相比,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。對(duì)照組HE和尼氏染色基本正常,實(shí)驗(yàn)組顯示隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng),脊髓病理學(xué)變化逐漸加重,脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元更明顯,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元尼氏體淡染或消失。3.1 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),正常的脊髓中HIF-1α保持在較低水平；脊髓損傷后6-72小時(shí),HIF-1α的表達(dá)明增加；1周后,其表達(dá)開始下降。HIF-1α mRNA的表達(dá)是與脊髓損傷后缺血程度相互平行,尤其是在傷后2-3天HIF-1α的表達(dá)達(dá)到峰值。3.2損傷脊髓組織原位雜交顯示：幾乎所有的損傷區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞都表達(dá)HIF-α mRNA的,而在正常的脊髓表達(dá)非常弱。3.3免疫組化顯示損傷脊髓內(nèi)HIF。1α蛋白的表達(dá)明顯增加,其趨勢(shì)和HIF-1α mRNA的表達(dá)基本一致,但是蛋白的表達(dá)要比mRNA的表達(dá)要早。VEGF、EPO在正常脊髓組織中表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)低水平,在脊髓損傷的大鼠模型中損傷后的24小時(shí)表達(dá)開始增加,48-72小時(shí)中達(dá)到峰值并且逐漸下降。3.4應(yīng)用Western blots印跡技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的脊髓的AIF和caspase-3蛋白的表達(dá)水平。傷后6小時(shí)組AIF、caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加,3 d時(shí)達(dá)高峰,7 d凋亡相關(guān)基因表達(dá)逐日減少。TUNEL染色檢測(cè)各組脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。對(duì)照組手術(shù)組中只觀察到少數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。然而,在損傷后6小時(shí)組、12小時(shí)、24小時(shí)組觀察到具有高熒光信號(hào)的較多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,3d時(shí)凋亡細(xì)胞量最多,7d開始減少。3.5脊髓損傷患者外周血ELISA法檢測(cè)HIF-1α調(diào)控下游基因VEGF、EPO在外周血的表達(dá)明顯的升高,與正常人外周血比較差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：1.經(jīng)基因本體及其富集的通路研究發(fā)現(xiàn),SCI主要與炎癥和免疫有關(guān)。CD44可能是脊髓損傷進(jìn)展過程中免疫應(yīng)答的刺激因子。在脊髓損傷發(fā)病機(jī)制中RAC2與HIF1有明顯的相互作用,并起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。ARPC1B在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和活性中起基礎(chǔ)性作用。2.經(jīng)過我們改良的脊髓損傷模型可以模擬不同程度的脊髓損傷,并且可靠、簡(jiǎn)單具有高度重復(fù)性,病理改變穩(wěn)定。3.研究表明在脊髓損傷后,HIF-1a通過增加蛋白的穩(wěn)定性和上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性,其蛋白表達(dá)增加。隨著HIF-1a表達(dá)的上調(diào)其相應(yīng)的靶基因EPO和VEGF也隨之表達(dá)增加。結(jié)合病理過程發(fā)現(xiàn)HIF-1a表達(dá)上調(diào)可能參與了脊髓損傷后的低氧耐受、細(xì)胞凋亡和血管微環(huán)境的重建。4.我們的研究證實(shí)在急性損傷后脊髓細(xì)胞可能通過細(xì)胞凋亡造成脊髓組織的損害,這可能和臨床上相關(guān)的神經(jīng)癥狀后遺癥相關(guān)。但是脊髓組織可以通過自身的的HIF-1 Q及其靶基因等的時(shí)序性表達(dá)以幫助脊髓組織度過這種損傷的環(huán)境。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 生物信息學(xué)分析 低氧誘導(dǎo)因子 動(dòng)物模型 表達(dá)方式
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-18
• 第一部分 大鼠急性脊髓損傷中的表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析18-30
• 前言18-19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>19-20
• 1.2 材料與方法20-21
• 1.3 結(jié)果21-22
• 1.4 討論22-26
• 1.5 結(jié)論26-27
• 1.6 附圖表27-30
• 第二部分 改良大鼠急性脊髓損傷模型的再評(píng)價(jià)及應(yīng)用研究30-42
• 前言30
• 2.1 資料和方法30-34
• 2.2 結(jié)果34-35
• 2.3 討論35-39
• 2.4 附圖表39-42
• 第三部分 HIF-1α及其相關(guān)基因在大鼠急性脊髓損傷和臨床SCI患者外周血中的實(shí)驗(yàn)研究42-66
• 3.1 資料與方法43-54
• 3.2 結(jié)果54-56
• 3.3 討論56-61
• 3.4 結(jié)論61-62
• 3.5 附圖表62-66
• 參考文獻(xiàn)66-76
• 致謝76-77
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文77-78
• 外文論文Ⅰ78-92
• 外文論文Ⅱ92-106
• 論文評(píng)閱及答辨情況表106

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 盧e，

本文編號(hào)：667414