本文關(guān)鍵詞：氯化甲基汞慢性暴露對子代海馬神經(jīng)損傷的實驗研究

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【摘要】：自日本發(fā)生水俁病后,氯化甲基汞(Methyl Mercuric Chloride MMC)對人體的危害逐漸引起人們重視。研究發(fā)現(xiàn)MMC對神經(jīng)系統(tǒng)具有強烈毒性作用,且極易通過胎盤進入胎兒體內(nèi),在胎、幼兒體內(nèi)有高水平的蓄積。近年來,對甲基汞的研究逐漸從大規(guī)模人群流行病學(xué)調(diào)查和一般損傷的毒理學(xué)研究轉(zhuǎn)向細胞和分子水平,對甲基汞的生殖毒性和遺傳毒性的研究已成為甲基汞毒性作用的重要內(nèi)容之一。妊娠母體接觸不足以引起母體任何癥狀劑量的MMC,其出生后的幼兒出現(xiàn)智能低下、精細行為和運動障礙、神經(jīng)發(fā)育遲緩等癥狀,而且這種損害是廣泛而長期的。研究認為,造成認知功能障礙的主要原因是腦海馬受損,而且這種損傷是不可逆的。氫質(zhì)子磁共振波譜(1H Magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)是一種無創(chuàng)性、可直接觀察人體內(nèi)生化物質(zhì)改變的新型影像學(xué)技術(shù)。本研究目的是探索能否運用安全、無創(chuàng)的1H-MRS技術(shù),評估甲基汞慢性暴露后子代大鼠腦海馬損傷情況,用HE染色、電鏡超微結(jié)構(gòu)改變來驗證1H-MRS檢查的結(jié)果,為氯化甲基汞腦海馬損傷的早期臨床診斷,病情分析,早期治療提供理論依據(jù)。本實驗分兩部分進行,分別對子代發(fā)育期、性成熟期大鼠進行實驗。第一部分方法：SD大鼠共16只(雌雄比3：1),年齡約2月齡,購自武漢大學(xué)動物實驗中心。合籠后,于次日早晨進入動物房檢查雌性大鼠陰栓。隨機將受孕雌鼠分為三組,每組4只,分別為高劑量氯化甲基汞組(H-MMC)、低劑量組(L-MMC)、對照組(C-NACL)。自受孕當天開始、每天定時定量分別給予：高劑量組4mg/kg MMC,低劑量組2mg/kg MMc,對照組即C-NaCl組4mg/kg NaCl,給藥方式為灌胃給藥。給藥時間持續(xù)至子代大鼠哺乳期結(jié)束即子代大鼠約3周齡。染毒結(jié)束后,隨機抽取3組仔鼠中的4只(不分性別)行右側(cè)海馬1H-MRS采集工作。所采用的檢查設(shè)備為中科院武漢磁共振中心的德國Bruker公司所生產(chǎn)的、7.0 T小動物磁共振成像儀。運用1H-MRS技術(shù)對大鼠右側(cè)海馬代謝物比值NAA/Cr(N-乙酰天門冬氨酸/肌酸)、CHO/Cr(膽堿/肌酸),mI/Cr(肌醇/肌酸)進行檢測。心臟灌注法處死大鼠取出大鼠腦海馬組織,用常規(guī)HE染色和電子顯微鏡兩種方法觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和海馬超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：各組仔鼠的早期生理發(fā)育指標(各組仔鼠數(shù)量、張耳、切齒萌出、睜眼等)相比,差別無統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色結(jié)果：高劑量組子代大鼠腦皮層疏松水腫,海馬大量神經(jīng)元變性壞死以及核固縮,膠質(zhì)細胞增生等,還出現(xiàn)大量空泡化。低劑量染毒組：子代大鼠腦皮層少量神經(jīng)元變性壞死、核固縮,海馬出現(xiàn)少量空泡化。對照組海馬結(jié)構(gòu)未見異常。電鏡結(jié)果顯示：高劑量組電鏡可見部分神經(jīng)細胞變性明顯,線粒體腫脹,海馬區(qū)神經(jīng)突起溶解、固縮和神經(jīng)元細胞核溶解,星形細胞空泡變性等。低劑量組：部分神經(jīng)細胞變性,可以觀測到神經(jīng)元核形態(tài)不規(guī)則、核結(jié)構(gòu)不清,胞體固縮以及線粒體變性,突起的髓鞘溶解、微絲和微管部分溶解、線粒體空泡變性等。對照組腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞組織結(jié)構(gòu)較好。1H-MRS檢查：高劑量組NAA/Cr明顯降低(P0.05),Cho/Cr、mI/Cr顯著升高(P0.05),可見明顯乳酸峰。低劑量組NAA/Cr亦降低,Cho/Cr、ml/Cr顯著升高(P0.05),可見雙乳酸峰,峰值低于高劑量組。高、低劑量組間無顯著性差異(P0.05)。第二部分方法：繼續(xù)飼養(yǎng)上述三組大鼠至性成熟期(約出生9周),每組隨機選取8只(不分性別),用Morris水迷宮檢測3組大鼠認知功能；連續(xù)訓(xùn)練5天,第6天用空間探索實驗的目標象限穿梭次數(shù)檢測三組大鼠記憶和學(xué)習(xí)方面的認知功能。運用1H-MRS技術(shù)對大鼠右側(cè)海馬代謝物比NAA/Cr、CHO/Cr、mI/C進行檢測。心臟灌注法取出大鼠海馬,用HE染色和電子顯微鏡兩種病理檢查觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和海馬超微結(jié)構(gòu)改變情況。結(jié)果：Morris水迷宮實驗高劑量組大鼠在第2-5天找到平臺時間多于對照組,在第4-5天找到平臺時間多于低劑量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；低劑量組與對照組相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。高劑量組穿梭次數(shù)(0.63±0.74)明顯低于對照組(3.13±1.56),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：低劑量組穿梭次數(shù)(1.00±0.76)與對照組(3.13±1.56)比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。病理檢查：高劑量組HE染色皮層疏松水腫,大量神經(jīng)元變性壞死,核固縮,膠質(zhì)細胞增生,海馬出現(xiàn)大量空泡化。電子顯微鏡觀察,可見高爾基復(fù)合體腫脹、溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張成池以及細胞間質(zhì)嚴重水腫。低劑量組HE染色,皮層少量神經(jīng)元變性壞死,核固縮；海馬出現(xiàn)少量空泡化。電子顯微鏡可以觀測到神經(jīng)元核形態(tài)不規(guī)則、核結(jié)構(gòu)不清,胞體固縮以及線粒體變性。對照組病理檢查未見明顯異常。1H-MRS檢測：與對照組比較,高劑量組NAA/Cr降低,Cho/Cr、mI/Cr顯著升高(P0.05),可見明顯乳酸峰。低劑量組NAA/Cr降低,Cho/Cr、mI/Cr升高(P0.05),未見明顯乳酸峰,峰值低于高劑量組。高、低劑量組間差異無顯著性(P0.05)。高、低劑量組對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：本次實驗利用氯化甲基汞染毒法,成功制備了早期慢性暴露氯化甲基汞損傷子代大鼠腦海馬動物模型,實驗組仔鼠的早期生理發(fā)育指標無異常。1H-MRS顯示高、低劑量組NAA/Cr降低,表明海馬區(qū)神經(jīng)元活性降低,神經(jīng)元形態(tài)萎縮、變性、丟失。CHO/Cr升高,提示細胞膜受損、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖加速。mI/cr升高反映了神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖活躍。出現(xiàn)雙乳酸峰,提示線粒體受損。光學(xué)顯微鏡及電鏡證實：實驗組腦皮層及海馬明顯受損。發(fā)育期氯化甲基汞慢性暴露至成年后,Morris水迷宮實驗證實高劑量組造成大鼠認知功能的損害仍不能恢復(fù),低量組認知功能損害不明顯。1H-MRS檢查結(jié)果提示兩組大鼠的腦海馬代謝產(chǎn)物均有改變,其結(jié)果亦得到HE病理、電鏡檢查結(jié)果證實,說明1H-MRS檢查比水迷宮試驗更為敏感。本研究結(jié)果表明1H-MRS可以反應(yīng)活體腦海馬損傷情況,指標敏感,與病理改變有高度相關(guān)性。為氯化甲基汞腦海馬損傷的早期臨床診斷,病情分析,早期治療提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：氯化甲基汞 質(zhì)子磁共振波譜 海馬 認知功能障礙
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 主要縮略詞一覽表14-15
• 研究背景15-17
• 第一部分 氯化甲基汞慢性暴露對子代大鼠腦海馬的影響17-32
• 2 材料與方法17-23
• 3 結(jié)果23-32
• 第二部分 氯化甲基汞慢性暴露對成年大鼠腦海馬的影響32-45
• 4 對象與方法32-37
• 5 結(jié)果37-45
• 討論45-56
• 實驗結(jié)論56-57
• 本次試驗的局限性57-58
• 參考文獻58-68
• 綜述68-83
• 參考文獻77-83
• 博士在讀期間發(fā)表論文83-85
• 致謝85

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