本文關(guān)鍵詞：苔類植物聯(lián)芐合成相關(guān)基因功能鑒定及催化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：苔蘚植物是介于藻類和蕨類植物之間的一個(gè)非常重要的植物類群,可以分為苔綱、蘚綱和角苔綱。苔類植物富含萜類和芳香類化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣并具有多種多樣的生物活性,如抗真菌、細(xì)胞毒、昆蟲(chóng)拒食、自由基清除等,因此苔類植物成為生物活性天然產(chǎn)物的寶庫(kù)。但是由于苔類植物本身的生長(zhǎng)環(huán)境特殊、個(gè)體矮小且往往種間雜生,很難富集到大量的高純度的材料進(jìn)行研究。分子生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展為解決該問(wèn)題提供了一個(gè)途徑。前人通過(guò)同位素追蹤法提出了苔類植物中雙聯(lián)芐類化合物的生物合成途徑,但是對(duì)于催化其生物合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶研究的還比較少,因此,尋找催化苔類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶,闡明重要次級(jí)代謝物的生物合成途徑,通過(guò)代謝工程手段提高天然活性產(chǎn)物的含量,是解決活性化合物來(lái)源的一個(gè)重要途徑。本研究通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)EST測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法得到了鈍鱗紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)和粗裂地錢(Marchantia paleacea)中聯(lián)芐類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因,并對(duì)其中幾個(gè)進(jìn)行了詳細(xì)研究。包括苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶苯丙氨酸裂解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL),鑒定了其體外生化特征并對(duì)非生物脅迫條件下PAL的表達(dá)與聯(lián)芐含量的關(guān)系進(jìn)行了初步探討；克隆了兩個(gè)細(xì)胞色素P450基因,對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其與聯(lián)芐生物合成具有一定的相關(guān)性；對(duì)苔類植物中克隆得到的兩類羧酸芪類合成酶(stilbenecarboxylate synthase, STCS) STCS1和STCS2的進(jìn)行了體外酶活分析,對(duì)其底物選擇性進(jìn)行了初步探討,并獲得了STCS1的蛋白晶體,收集到高分辨數(shù)據(jù),對(duì)其可能的選擇機(jī)制進(jìn)行了初步闡述。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括：1.苔類植物聯(lián)芐合成途徑——苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,苯丙氨酸裂解酶(PAL)的克隆及功能研究從鈍鱗紫背苔cDNA文庫(kù)EST測(cè)序結(jié)果中得到一個(gè)注釋為苯丙氨酸裂解酶(PAL)的基因片段,通過(guò)5'RACE方法得到其全長(zhǎng)cDNA序列,生物信息學(xué)分析顯示,與其他植物來(lái)源的PALs具有60-75%的同源性,具有Ala-Ser-Gly催化三聯(lián)體和其他保守活性氨基酸,同源建模模擬得到其三維結(jié)構(gòu)模型,與來(lái)自歐芹的PcPAL整體折疊和保守結(jié)構(gòu)域類似,這些分析表明其是一個(gè)苯丙氨酸裂解酶,命名為PaPAL。對(duì)其進(jìn)化地位進(jìn)行分析,結(jié)果表明PaPAL與蕨類、苔蘚類和裸子植物的PALs親緣關(guān)系比較近,與傳統(tǒng)的植物進(jìn)化進(jìn)程一致。另外,以基因組DNA為模板擴(kuò)增得到基因序列,與cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),基因編碼區(qū)只有一個(gè)外顯子,沒(méi)有內(nèi)含子。構(gòu)建PaPAL的原核表達(dá)載體并且轉(zhuǎn)入表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行體外酶活鑒定,結(jié)果顯示PaPAL能夠高效的催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸,并能夠以L-酪氨酸為底物產(chǎn)生對(duì)羥基肉桂酸,是一個(gè)雙功能酶,但對(duì)兩種底物的催化效率有差別,酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析表明L-苯丙氨酸是PaPAL的最適底物。此外,PaPAL的表達(dá)受到激素茉莉酸甲酯(MeJA)和脫落酸(ABA)的誘導(dǎo),而且激素誘導(dǎo)條件下葉狀體聯(lián)芐含量與PaPAL的表達(dá)有一定的正相關(guān)。2.查爾酮合成酶家族基因的克隆和功能研究通過(guò)對(duì)粗裂地錢在特定配子體階段轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,得到一些標(biāo)注為查爾酮合成酶基因的序列,選取其中4個(gè)克隆進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增,得到基因序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的MpSTCS1,2具有較高同源性,因此被命名為MPaSTCS1-4。對(duì)克隆得到的STCSs序列進(jìn)行分析,它們與其他CHSs有很高的同源性,并具有保守的催化位點(diǎn)Cys-His-Asn及其他保守氨基酸,表明他們都屬于CHS超家族,可能具有查爾酮合成酶功能。構(gòu)建STCSs基因的原核表達(dá)體系,得到純化的蛋白并進(jìn)行體外酶活檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這4個(gè)STCSs根據(jù)催化底物酶活效率的不同可以分為兩類。以二氫對(duì)羥基香豆酰輔酶A (dihydro-p-coumaroyl-CoA)為起始底物,它們都能夠發(fā)生C6/C1環(huán)化生成根皮素(phloretin)和內(nèi)酯化產(chǎn)物dihydro-4-coumaroyltriacetic acid lactone (dihydro-CTAL)和dihydrobisnoryangonin (dihydro-BNY)。但是以對(duì)羥基香豆酰輔酶A (p-coumaroyl-Co A)為起始底物時(shí),MPaSTCS2能夠催化發(fā)生C6/C1環(huán)化生成柚皮素,而另外3個(gè)STCSs與STCS2催化效率相差很大,只能生成痕量的柚皮素(質(zhì)譜檢測(cè)到),主要產(chǎn)物是內(nèi)酯化的α-吡喃酮衍生物CTAL和BNY。這兩類STCSs對(duì)這兩種底物具有明顯的選擇性,但是現(xiàn)有的研究結(jié)果還無(wú)法解釋這種差異的來(lái)源,我們期望從結(jié)構(gòu)角度來(lái)解釋這種差異,并進(jìn)一步闡明催化機(jī)制。我們選取MPaSTCS1進(jìn)行進(jìn)一步的晶體學(xué)研究。3.對(duì)STCS1蛋白的初步晶體學(xué)研究利用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行STCS1表達(dá),純化得到大量單一的STCS1蛋白,初步篩選得到微晶。然后優(yōu)化結(jié)晶條件,得到較大的晶體進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn),獲得2.4A高分辨的衍射數(shù)據(jù),通過(guò)分子置換、模型修正等方法,得到STCS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。STCS1的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)功能二聚體形式,每個(gè)不對(duì)稱單位中含有六個(gè)STCS1分子。STCS1單體包含上下兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,總體呈現(xiàn)出αβαβα假對(duì)稱模式,上下部分之間有一個(gè)裂縫,形成活性空腔。將其與同源蛋白MpSTCS2和MsCHS進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),發(fā)現(xiàn)三者的三維結(jié)構(gòu)非常類似,僅在活性位點(diǎn)附近有細(xì)微的差別。將STCS1晶體結(jié)構(gòu)分別與底物和產(chǎn)物分子進(jìn)行對(duì)接,分析與底物分子或產(chǎn)物分子相互作用的氨基酸殘基及作用特點(diǎn),并與經(jīng)典的CHS和底物／產(chǎn)物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,尋找STCS1與CHS催化活性位點(diǎn)的差別,從結(jié)構(gòu)角度解釋STCS1與CHS對(duì)底物選擇性差別。4.次級(jí)代謝途徑相關(guān)P450的克隆及功能初步研究分析鈍鱗紫背苔cDNA文庫(kù)EST測(cè)序結(jié)果,找到幾十個(gè)標(biāo)注為細(xì)胞色素P450的序列。選取其中幾個(gè)在愈傷組織、培養(yǎng)的葉狀體及野生型葉狀體中進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)其中幾個(gè)基因在聯(lián)芐含量高的組織中表達(dá)量明顯升高,推測(cè)可能與其聯(lián)芐的合成代謝相關(guān)。選取其中兩個(gè)基因通過(guò)5'RACE方法克隆了它們的全長(zhǎng),并擴(kuò)增得到它們的cDNA及基因組序列,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的編碼區(qū)都有2個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析顯示,它們屬于P450家族,與CYP75家族具有較高的同源性,具有P450的保守結(jié)構(gòu)域,包括高度保守的血紅素結(jié)合部位FxxGxRxCxG和另外幾個(gè)P450s的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域和序列A/GGxD/ETT/S (I-helix), KETLR (K-helix)和PERF/W等。構(gòu)建了P450s的體外表達(dá)及酶活檢測(cè)體系,為進(jìn)行下一步體外及體內(nèi)功能研究提供了基礎(chǔ)。此外,這兩個(gè)P450的表達(dá)受到激素的誘導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：苔類植物 次級(jí)代謝途徑 苯丙氨酸氨裂解酶 查爾酮合成酶 羧酸芪類合成酶 P450 蛋白晶體 非生物脅迫
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914
【目錄】：

• 摘要7-11
• Abstract11-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-48
• 1 苔蘚植物16-17
• 2 苔類植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用17-18
• 3 聯(lián)芐類化合物次級(jí)代謝途徑研究18-20
• 3.1 聯(lián)芐及雙聯(lián)芐類化合物(Bibenzyls and Bisbibenzyls)18-19
• 3.2 聯(lián)芐類化合物生物合成途徑研究19-20
• 4 苔類植物次級(jí)代謝途徑關(guān)鍵酶20-37
• 4.1 苯丙氨酸裂解酶20-22
• 4.2 肉桂酸-4-羥化酶22-23
• 4.3 4-香豆酸：輔酶A連接酶23
• 4.4 Ⅲ型聚酮合酶家族23-33
• 4.5 NADPH-依賴的聚酮還原酶33-35
• 4.6 植物細(xì)胞色素P45035-37
• 5 本論文立題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容37-39
• 參考文獻(xiàn)39-48
• 第二章 鈍鱗紫背苔苯丙氨酸氨裂解酶(PaPAL)的克隆和功能鑒定及在非生物脅迫應(yīng)答中的表達(dá)特征48-78
• 1 引言48-50
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑50-53
• 2.1 植物材料50
• 2.2 菌株與質(zhì)粒50
• 2.3 酶和試劑50-51
• 2.4 主要溶液和培養(yǎng)基51-52
• 2.5 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備52
• 2.6 PCR引物序列52-53
• 3 實(shí)驗(yàn)方法53-58
• 3.1 鈍鱗紫背苔中苯丙氨酸裂解酶PaPAL的克隆53-54
• 3.2 PaPAL的原核表達(dá)54-56
• 3.3 PaPAL體外酶活鑒定56-57
• 3.4 PaPAL在非生物脅迫應(yīng)答中的反應(yīng)57-58
• 3.5 在非生物脅迫應(yīng)答中植物葉狀體成分的變化58
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-73
• 4.1 鈍鱗紫背苔中PaPAL的克隆及序列分析58-66
• 4.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化66-68
• 4.3 體外活性檢測(cè)結(jié)果68-70
• 4.4 非生物脅迫條件下PaPAL的表達(dá)變化及對(duì)成分的影響70-73
• 5 本章小結(jié)73
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 第三章 苔類植物STCSs蛋白功能研究78-97
• 1 引言78-79
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法79-82
• 2.1 植物材料及菌株與質(zhì)粒79
• 2.2 PCR引物序列79-80
• 2.3 粗裂地錢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析80
• 2.4 目的基因cDNA及基因組DNA全長(zhǎng)擴(kuò)增80
• 2.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)80
• 2.6 體外酶活鑒定80-82
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論82-94
• 3.1 STCSs的克隆和序列分析82-86
• 3.2 STCSs進(jìn)化樹(shù)分析86-88
• 3.3 STCSs基因組分析88-89
• 3.4 原核表達(dá)89-90
• 3.5 體外酶活結(jié)果與分析90-94
• 4 本章小結(jié)94-95
• 參考文獻(xiàn)95-97
• 第四章 STCS1蛋白功能及初步晶體學(xué)研究97-127
• 1 引言97-98
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法98-105
• 2.1 菌株與質(zhì)粒98-99
• 2.2 試劑和儀器99
• 2.3 培養(yǎng)基和溶液配制99-100
• 2.4 蛋白表達(dá)載體構(gòu)建100
• 2.5 蛋白表達(dá)檢測(cè)及大量制備100-102
• 2.6 STCS1晶體的獲得102-104
• 2.7 晶體結(jié)構(gòu)的解析104-105
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論105-124
• 3.1 STCS1蛋白表達(dá)與小量制備105-109
• 3.2 STCS1蛋白大量制備109-111
• 3.3 STCS1蛋白晶體的獲得與數(shù)據(jù)收集111-115
• 3.4 晶體結(jié)構(gòu)與模型修正115-117
• 3.5 STCS1整體結(jié)構(gòu)描述117-120
• 3.6 STCS1與同源序列比對(duì)120-121
• 3.7 STCS1與底物及產(chǎn)物分子對(duì)接121-123
• 3.8 STCS1活性位點(diǎn)與催化機(jī)制探討123-124
• 4 本章小結(jié)124
• 參考文獻(xiàn)124-127
• 第五章 聯(lián)芐合成途徑相關(guān)P450克隆及功能研究127-148
• 1 引言127
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法127-132
• 2.1 植物材料及菌株與質(zhì)粒127-128
• 2.2 試劑溶液、酶等128
• 2.3 PCR引物序列128-129
• 2.4 苔類植物不同類型的組織P450表達(dá)差異129
• 2.5 基因克隆及序列分析129-130
• 2.6 酵母表達(dá)、微粒體制備130-132
• 2.7 體外酶活檢測(cè)132
• 2.8 兩個(gè)P450基因在激素處理后的表達(dá)特征132
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果132-144
• 3.1 苔類植物中P450在不同組織差異表達(dá)分析132-133
• 3.2 苔類植物中兩個(gè)P450的克隆及序列分析133-140
• 3.3 PaF3'H1與PaF3'H2進(jìn)化分析140-141
• 3.4 P450酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化141
• 3.5 微粒體制備及體外酶活檢測(cè)141-143
• 3.6 激素刺激因子引起P450表達(dá)的變化143-144
• 4 小結(jié)144-145
• 5 下一步工作計(jì)劃145
• 參考文獻(xiàn)145-148
• 致謝148-149
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄149-150
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表150

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 武一鳳;鈍鱗紫背苔苯丙素及聯(lián)芐類化合物生物合成機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：苔類植物聯(lián)芐合成相關(guān)基因功能鑒定及催化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：422400