人類免疫缺陷病毒-1型(Human Immunodeficiency Virus,HIV-1)屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬,其基因組由兩條單股正鏈RNA組成。目前由于該病毒在感染人體內(nèi)極易發(fā)生變異,并具有復雜的免疫逃逸機制,因此仍沒有有效的疫苗進行預防。HIV-1在宿主細胞內(nèi)完成其復制過程大體需要以下幾個環(huán)節(jié):首先病毒囊膜蛋白與細胞表面的受體和輔佐受體結合、脫殼、逆轉錄形成雙鏈cDNA進入細胞核、整合到宿主基因組、病毒基因的轉錄和剪切、病毒mRNA轉運至細胞質(zhì)、翻譯病毒的結構蛋白和非結構蛋白、病毒粒子的出芽、成熟及釋放等。HIV-1病毒在人體內(nèi)需要借助大量的宿主因子完成其復制過程。ANP32A和ANP32B均屬于ANP32蛋白家族成員,其結構比較保守,N端為亮氨酸富集區(qū),C端為酸性結構域。據(jù)報道ANP32A&B蛋白可以通過影響聚合酶的活性參與流感病毒的復制過程,而且可以促進逆轉錄病毒科中泡沫病毒RNA的核輸出過程,但是其具體的機制以及對其它逆轉錄病毒的影響仍沒有明確的報道。為了探索ANP32A&B在HIV-1復制中的作用,本研究首先利用CRISPR/Cas9技術構建了ANP3...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 HIV-1概述
        1.1.1 艾滋病流行病學
        1.1.2 HIV-1病毒的基因組
        1.1.3 HIV-1病毒的生活周期
        1.1.4 HIV-1病毒感染的臨床癥狀
        1.1.5 HIV-1病毒的蛋白功能
    1.2 HIV-1與宿主的相互作用
        1.2.1 能夠抑制HIV-1復制的宿主限制因子
        1.2.2 能夠支持HIV-1復制的宿主輔助因子
    1.3 ANP32蛋白研究概述
        1.3.1 ANP32蛋白簡介
        1.3.2 ANP32蛋白的結構
        1.3.3 ANP32蛋白調(diào)控細胞內(nèi)的轉運過程
        1.3.4 ANP32蛋白家族調(diào)節(jié)磷酸酶的活性
        1.3.5 ANP32蛋白可以調(diào)節(jié)核染色質(zhì)的結構
        1.3.6 ANP32蛋白在細胞內(nèi)的分布
        1.3.7 ANP32蛋白家族與人類疾病之間的關系
        1.3.8 ANP32A&B對病毒復制的影響
    1.4 研究目的與意義
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞與病毒
        2.1.2 實驗所用儀器
        2.1.3 實驗所用試劑
        2.1.4 實驗所用抗體
        2.1.5 實驗所用質(zhì)粒
    2.2 方法
        2.2.1 Western blot檢測
        2.2.2 ANP32A和ANP32B guide RNA引物的設計和質(zhì)粒的構建
            2.2.2.1 PCR反應
            2.2.2.2 轉化
            2.2.2.3 質(zhì)粒提取
        2.2.3 ANP32A和ANP32B單基因和雙基因敲除細胞系的構建
            2.2.3.1 質(zhì)粒轉染至細胞
            2.2.3.2 細胞RNA提取
            2.2.3.3 RNA反轉錄
            2.2.3.4 PCR產(chǎn)物膠回收
            2.2.3.5 目的片段與載體的連接
        2.2.4 組織細胞DNA提取
        2.2.5 RNA的核質(zhì)分離提取
        2.2.6 熒光定量PCR
        2.2.7 RNA Scope
        2.2.8 激光共聚焦
        2.2.9 免疫共沉淀
        2.2.10 雙分子熒光互補技術(BiFC)
        2.2.11 假病毒的包裝
        2.2.12 嘌呤霉素工作濃度的確定
        2.2.13 假病毒的制備
        2.2.14 穩(wěn)定補回表達ANP32A或者ANP32B細胞系的建立
        2.2.15 數(shù)據(jù)處理與分析
第三章 主要研究結果
    3.1 ANP32A和ANP32B氨基酸序列和蛋白結構分析
    3.2 ANP32A和ANP32B基因敲除細胞系的構建
        3.2.1 ANP32A和ANP32B基因敲除細胞系WB鑒定
        3.2.2 ANP32A和ANP32B mRNA在各個細胞系中的熒光定量分析
    3.3 ANP32A&B雙基因缺失顯著降低HIV-1病毒組裝和Gag蛋白表達
    3.4 穩(wěn)定表達ANP32A和ANP32B細胞系的建立及功能驗證
    3.5 ANP32A和ANP32B基因缺失對早晚期逆轉錄產(chǎn)物的影響
    3.6 ANP32A和ANP32B基因缺失抑制HIV-1總RNA的產(chǎn)生
    3.7 ANP32A&B雙基因缺失抑制HIV-1未完全剪切mRNA的核輸出過程
    3.8 RNAScope證明ANP32A&B雙基因缺失后大部分gag mRNA被阻滯在細胞核中
    3.9 ANP32A&B特異性的影響RRE依賴的RNA的轉運過程
    3.10 ANP32A&B能夠與Rev蛋白發(fā)生相互作用
    3.11 ANP32A&B功能的發(fā)揮依賴CRM1核輸出途徑
    3.12 CRM1與Rev的相互作用并不依賴于ANP32A&B
第四章 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：4045450