本文關(guān)鍵詞：年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細胞Klotho基因的表達及甲基化水平初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：觀察正常人晶體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)晶體上皮細胞(lens epithelial cell, LECs)中Klotho基因mRNA、蛋白表達情況及甲基水平,分析Klotho基因與ARC之間的關(guān)系,探討該基因的表觀遺傳變化在ARC發(fā)生中的調(diào)控機制。材料與方法：1.標本收集：收集2013年9月至2014月10月在河南省人民醫(yī)院眼科行年齡相關(guān)性白內(nèi)障手術(shù)的住院患者60例(患眼60只),均選擇第3期成熟期皮質(zhì)性白內(nèi)障。術(shù)前排除糖尿病、高血壓、心臟病等全身疾患,并排除虹膜睫狀體炎、青光眼、眼外傷,以及長期眼放射線接觸等眼病史,男女不限。實驗分組為成青年透明晶體(A組18-30歲,平均年齡,mean±SD,25.00±3.97歲)30例(30眼),男13例,女17例；中年ARC組(B組40-49歲,平均年齡,mean±SD,45.33±3.15歲)30例(30眼)男11例,女19例；老年ARC組(C組67-85歲,平均年齡,mean±SD,75.53±5.76歲)30例(30眼),男12例,女18例。術(shù)前由同一醫(yī)生檢查和記錄患者性別、年齡、晶狀體混濁程度和類型。白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)由同一醫(yī)生進行,術(shù)中常規(guī)連續(xù)環(huán)形撕囊,直徑約5.5mm。正常人晶體(normal transparent group)前囊膜來源于河南省立眼科研究所眼庫角膜移植術(shù)后透明晶體眼球,顯微鏡下同樣方法留取正常青年人晶狀體前囊膜作為對照組。所有晶體前囊膜置于PBS緩沖液中沖洗,排除血液、虹膜色素、晶體皮質(zhì)、玻璃體等眼內(nèi)組織的附著。以上取材均通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意。將獲得樣品立即置與-80℃冰箱保存。進行基因、蛋白及甲基化檢測。2.Klotho基因RT-PCR檢測mRNA:將收集的晶體前囊膜迅速加入Trizol的Eppendofff管,PBS沖洗,離心沉淀5×105個細胞,去上清,加入細胞裂解液,離心5min,吸盡液體,干燥RNA, 1min,加入焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水溶解,-80℃冷凍保存。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:測得比值在0.6～1.19之間。普通瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質(zhì)量鑒定：(1)制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖,加入1x電泳緩沖液,待水合數(shù)分鐘后,置微波爐中將瓊脂糖融化均勻,加熱時應蓋上封口膜。(2)膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙,待膠溶液冷卻至50℃左右時,輕輕倒入電泳制膠板上,除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后,垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi),加入1x電泳緩沖液,使電泳緩沖液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(3)加樣：在薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)為2X。用10μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)。4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳。(5)觀察和拍照：電泳完畢,取出凝膠。電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘,于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。引物設計：利用網(wǎng)絡資源GenBank (Klotho ID:16591; Klotho mRNA: NM-013823.1)獲得人Klotho基因序列,使用軟件Primer Premier5.0設計特異性引物,正義：5'-ACCTGGTGGCGCACAC, 反義:5'-TTGGCAAACCAACC TAGTACA;GAPDH正義：5'-GAAGGTGAAGGTCG GAGT,反義5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC.反轉(zhuǎn)錄反應條件：20℃10min,42℃60min使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,70℃10min滅火反轉(zhuǎn)錄酶,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩T-PCR的檢測：常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)適當濃度瓊脂糖凝膠電泳成像分析,目的條帶清晰,且沒有雜帶,說明引物設計合成無誤,可以進行熒光定量PCR。實時熒光定量PCR的檢測：由美國ABI公司合成TaqMan探針,熒光定量PCR儀上進行擴增。Klotho-PCR基因的反應體系：10×PCR緩沖液(Mg2+ free) 3.0μ1; MgCl2 (25mmol/L) 1.8μl; dNTP (25mmol/L) 0.36μl;上游引物(10μmol/L)1.0μ1；下游引物(10μmol/L) 1.0μl; Taq酶(5U/μ1)。進行溶解曲線分析及瓊脂糖凝聚電泳驗證擴增。每個樣本均檢測3次,取其平均值,用2-△△Ct法計算Klotho mRNA在不同組別標本中的表達變化。3.免疫組化染色(immunohistochemistry,IHC):將收集的晶體前囊膜標本PBS液沖洗后,細胞面朝上平鋪于載玻片上,空氣干燥,ABC法染色,室溫下1：200山羊抗人Klotho抗體過夜,二抗驢抗羊1：50作用2小時,在DAB反應液中作用5min, PBS液沖洗、終止染色,干燥后封片。結(jié)果判定：隨機選取5個視野,計數(shù)50個細胞,計數(shù)陽性細胞數(shù),計算陽性細胞百分率。陽性細胞比例的評分方法為：0分(陽性細胞比例≤5%),1分(5%陽性細胞比例≤25%),2分(25%陽性細胞比例≤50%),3分(50%陽性細胞比例≤75%),4分(75%陽性細胞比例≤100%)。細胞的染色強度可分為0分(染色陰性),1分(淡黃色顆粒),2分(棕黃色顆粒),3分(褐色顆粒)；按照染色強度與陽性細胞比例綜合計分,根據(jù)上述2項結(jié)果乘積的分數(shù)分為4級,分數(shù)≤4記為-,4分數(shù)≤8記為+,8分數(shù)12記為++,分數(shù)=12記為+++。其中“-”記為Klotho表達陰性；“+”,“++”,,“+++”記為Klotho表達陽性。4.甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reacti on,MSP)檢測Klotho甲基化水平分別提取3組標本的DNA,取500ng DNA進行亞硫酸鹽處理,按照EZ DNA Methylation-Gold Kit,取處理后的DNA lul作為模板使用TaqGold DNA聚合酶進行甲基化特異性PCR擴增,反應體系12.5u1,反應條件：95℃變性10min,然后變性95℃30S,退火58℃30s,延伸72℃30S,共40個循環(huán),最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(EB)染色,在紫外檢測儀上觀察產(chǎn)物條帶。用MethPrimer軟件設計甲基化與未甲基引物：分別設計甲基化特異PCR引物(Klotho M primer)和非甲基化特異PCR引物(Klotho U primer)進行PCR反應。用甲基化特異引物進行PCR時,CpG島C堿基甲基化的DNA能產(chǎn)生特異PCR條帶,C堿基未甲基化的DNA則不能產(chǎn)生PCR條帶。通過觀察klotho基因在人晶體上皮細胞中甲基化和非甲基化特異引物PCR擴增情況來判斷是否甲基化陽性。引物信息為Klotho(M)正義：5'-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC,反義：5'-CAACAAACGCCGATAAT AACG。Klotho(U)正義：5'-TTGTTGTTGTTGTACTTTGTTATT反義5'-CCAAC AAACACCAATAATAAC。 (M):甲基化引物；(U)：非甲基引物。4.統(tǒng)計學處理采用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),當方差不齊時,采用Welch法進行組間比較；計數(shù)資料給出頻數(shù)及百分比,組間比較采用χ2檢驗；等級資料給出百分比及平均秩次,組間比較采用Kruskal-Wallis法。結(jié)果：1.Klotho基因在晶體上皮的表達水平：Klotho基因在正常青年人晶體組、中年白內(nèi)障組及老年白內(nèi)障組相對表達量分別是(mean±SD):1.097±0.140,0.023±0.004,0.004±0.002,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.Klotho蛋白在晶體上皮細胞的表達水平：正常青年人晶體組Klotho蛋白呈陽性、均勻表達,表達部位位于胞漿及胞膜,中年白內(nèi)障組表達呈弱陽性,位于晶體前囊膜邊緣位置,DAB顯色反應不均一,細胞形態(tài)變異,有偽足樣突起。老年白內(nèi)障組表達呈陰性。3組比較差異有顯著性(P0.05)。3.Klotho基因甲基化表達水平：透明晶體組、中年白內(nèi)障組及老年白內(nèi)障組甲基化發(fā)生率分別是3.3%,56.7%,93.3%。白內(nèi)障組甲基化發(fā)生率較透明晶體組明顯增高,差異有顯著性(P0.05)。Klotho基因甲基化與基因表達的關(guān)系：透明晶體組(A)低甲基化,老年年齡相關(guān)性白內(nèi)障組(C)出現(xiàn)高甲基化,三組比較甲基化陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：1.本研究首次發(fā)現(xiàn)Klotho基因在正常人晶體上皮細胞有表達,而mRNA及蛋白的表達均隨著年齡增加而下降。晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells, LECs)的衰老、凋亡是年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)發(fā)生的細胞學基礎。正常情況下,人類晶體上皮細胞為柱狀細胞其中央?yún)^(qū)生長相對靜止而赤道部分裂旺盛。赤道部晶狀體上皮細胞不斷分裂、分化,形成晶體纖維細胞并向核心推擠,使得晶狀體終生不停生長。這層細胞在終生生長過程中受環(huán)境中紫外線、過氧化物以及年齡老化等誘發(fā)因素的影響出現(xiàn)凋亡。抗衰老基因是否存在于人晶體上皮細胞,基因的表觀遺傳性狀改變是否影響了晶體上皮細胞的生物學活性、其與ARC的發(fā)生是否有關(guān),本實驗通過檢測直接取材于人的晶體前囊膜中Klotho的表達,從而證實了這一假說。2.Klotho蛋白在正常人晶體上皮表達,表達位置位于細胞漿。Klotho蛋白分為膜型和分泌型兩種,其中分泌性蛋白發(fā)揮重要功能,參與多個信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細胞凋亡率較正常晶體上皮細胞增加,而且出現(xiàn)充間質(zhì)化,本次實驗過程中我們觀察到了一個有意思的現(xiàn)象：中年白內(nèi)障組Klotho蛋白的表達位于晶體前囊囊邊緣的晶體上皮細胞,中心區(qū)無表達,隨著年齡增加,晶體上皮細胞形態(tài)變化,出現(xiàn)偽足樣改變,陽性反應不均一,這與既往的學說即：旁中央?yún)^(qū)晶體上皮細胞具有生發(fā)功能,中心區(qū)無生發(fā)功能相吻合,同時也提示,該基因及蛋白參與了晶體上皮細胞老化過程。3.Klotho基因在年輕正常透明晶體組低甲基化,基因及蛋白表達陽性；老年白內(nèi)障患者存在高甲基化,由于基因的表達沉默導致蛋白表達下降甚至不表達。我們推測可能由于Klotho基因表達沉默,導致功能蛋白陰性表達,因此無法發(fā)揮對晶體上皮的抗衰的保護作用導致細胞凋亡,進而誘發(fā)白內(nèi)障。由于實驗發(fā)現(xiàn)Klotho在透明及混濁晶體的甲基化水平發(fā)現(xiàn)隨著年齡增加Klotho甲基化率升高是該基因及蛋白表達下降的重要原因,后續(xù)的研究需要通過體外細胞培養(yǎng)、DNA去甲基化藥物干預進一步闡明這種機制。進一步的實驗數(shù)據(jù)比如Western-blotting檢測、細胞凋亡率及相關(guān)離子水平檢測以及其參與的細胞信號通路如P53通路的相關(guān)因子的檢測,也需進行體外細胞培養(yǎng)來完善,目前我們已經(jīng)收集了不同來源的人晶體上皮細胞株進行培養(yǎng),進行數(shù)據(jù)檢測。綜上所述,年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機制是個多因素的過程,抗衰老Klotho基因參與了ARC的發(fā)生、發(fā)展,其表觀遺傳的改變是老年性白內(nèi)障發(fā)病的原因之一,這一發(fā)現(xiàn)從衰老和表觀遺傳水平闡明了年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機制,值得深入研究。
【關(guān)鍵詞】：年齡相關(guān)性白內(nèi)障 晶體上皮細胞 Klotho 甲基化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-22
• 第1章 引言22-31
• 1.1 年齡相關(guān)性白內(nèi)障22-23
• 1.2 晶體上皮細胞與年齡相關(guān)性白內(nèi)障23-25
• 1.3 Klotho25-26
• 1.4 DNA甲基化與表觀遺傳調(diào)控機制26-28
• 1.5 立題意義及目的28-31
• 第2章 材料與方法31-55
• 2.1 標本收集31-32
• 2.2 主要試劑及儀器32-35
• 2.3 Real-time PCR操作35-41
• 2.4 免疫組化染色(immunohistochemistry,IHC)41-42
• 2.5 免疫熒光(immunofluorescence,IF)42-43
• 2.6 Western Blot43-49
• 2.7 甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chainreaction,MSP)49-54
• 2.8 細胞凋亡檢測54
• 2.9 統(tǒng)計學處理54-55
• 第3章 實驗結(jié)果55-67
• 3.1 患者臨床參數(shù)分析結(jié)果55-56
• 3.2. RT-PCR結(jié)果56-59
• 3.3 Klotho蛋白免疫組化(IHC)結(jié)果59-61
• 3.4 免疫熒光結(jié)果(IF)61-63
• 3.5 基因甲基化(MSP)結(jié)果63-64
• 3.6 Klotho蛋白Western blot結(jié)果64-65
• 3.7 老年組晶體前囊膜晶體上皮細胞凋亡情況65
• 3.8 Klotho基因RT-PCR、MSP甲基化及Klotho蛋白IHC結(jié)果分析65-67
• 第4章 討論67-74
• 4.1 Klotho基因及表達產(chǎn)物在晶體上皮細胞的表達67-70
• 4.2 Klotho甲基化水平與基因和蛋白表達的關(guān)系70-74
• 參考文獻74-82
• 文獻綜述82-102
• 參考文獻93-102
• 附錄縮略詞表102-103
• 在讀期間成果103-104
• 致謝104-109
• 統(tǒng)計合格證明109-110

  本文關(guān)鍵詞：年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細胞Klotho基因的表達及甲基化水平初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：393014