發(fā)布時間：2017-05-24 12:10

  本文關鍵詞：細胞周期因子FoxM1促進肝臟再殖的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近二十年來,臨床上一直致力于開展肝細胞移植技術的研究。作為原位肝移植(orthotopic liver transplantation)的替代方案,肝細胞移植技術研究取得了一定成效。然而,由于移植的肝細胞在宿主肝臟內增殖緩慢,存活時間有限,并且隨宿主自身肝細胞的更新而減少,治療性肝臟再殖(therapeutic liver repopulation)仍難以實現(xiàn)。建立有效的肝細胞治療方案仍然存在很大的困難,是目前肝細胞移植技術發(fā)展的瓶頸問題之一。肝臟再殖是移植的外源細胞及其所增殖的子代細胞參與受損肝臟結構的修復,并正常地發(fā)揮肝細胞生理功能的現(xiàn)象。外源供體細胞能夠留存于受體肝臟內并在數(shù)量與功能上具有治療意義的基本前提是移植的供體細胞要比內源肝細胞具有更強的生長或生存優(yōu)勢�；诂F(xiàn)有的認識,這一前提可以通過兩種策略來實現(xiàn)：一是抑制受體中內源肝細胞的增殖。例如,采用倒千里光堿等化學物質抑制受體肝細胞的增殖,以及應用受體肝細胞具有遺傳性缺陷的uPA小鼠或Fah基因剔除小鼠模型等。然而,以上模型都是通過誘發(fā)自身肝細胞的死亡從而獲得適于移植肝細胞增殖的肝臟微環(huán)境,這些方法盡管作為研究肝臟再殖的模型能夠在動物中實現(xiàn),然而在臨床應用中卻是不可行的。二是增強移植肝細胞在受體肝臟中的生長或生存優(yōu)勢。這種新策略的基本思路是通過調節(jié)移植肝細胞中細胞周期因子的表達,促進其內在的增殖能力,增強移植肝細胞對損傷肝臟的再殖能力。因此,如何選擇有效的細胞周期調控因子是目前該領域的關鍵問題；其次,利用什么樣的載體和方式穩(wěn)定、有效地調控肝細胞相關細胞周期因子的表達也是目前面臨的重要問題；同時,上調細胞周期因子是否會帶來成瘤風險等問題是必須考慮的安全性問題。本研究探討并嘗試解決這些重要科學問題。Fox轉錄因子超家族成員FoxMl作為細胞周期G1/S和G2/M進程的關鍵調節(jié)因子,是負責啟動細胞增殖的必需基因。研究發(fā)現(xiàn),FoxM1可以調控G1/S進程中必需蛋白質如Skp2、Cks1、p21、p27和Cdc25A的表達,同時也可調控有絲分裂相關蛋白如Cyclin B、Cdc25B、Survivin、Aurora B激酶、Polo-like激酶1、CENP-A、 CENP-B和CENP-F的表達。此外,提高FoxMl的表達能降低細胞周期抑制因子p27的表達水平,從而增加細胞周期激動劑如Cdc25B的水平,進而促進肝臟再生。進行部分肝切后,以生長激素處理來誘導高齡小鼠的FoxM1表達,可恢復其正常的肝再生能力,而通過腺病毒載體介導FoxM1的瞬時表達也可達到相同的效果。FoxM1過表達的小鼠部分肝切后,持續(xù)表達FoxM1的肝細胞與野生型肝細胞相比,至少提前8小時進入S期,這種增殖優(yōu)勢與DNA復制及有絲分裂必需基因的提前激活有關。在部分肝切誘導的小鼠肝再生過程中,FoxM1失活可降低肝細胞DNA的復制水平、阻滯細胞的有絲分裂。更重要的是,肝甲狀腺素結合蛋白啟動子(TTR)調控FoxM1在肝組織中的長期表達并不導致自發(fā)性肝細胞癌的產(chǎn)生；以二甲基硝胺／苯巴比妥(DEN/PB)作為肝細胞癌發(fā)生的誘導劑,肝臟持續(xù)表達FoxM1的小鼠與野生型小鼠相比,其肝癌發(fā)生率及程度并無差別。這都表明TTR-FoxM1轉基因小鼠肝細胞中FoxM1的穩(wěn)定表達并不會導致肝細胞癌的發(fā)生�；谝陨详P于"FoxMl可以促進肝細胞增殖而不會誘發(fā)腫瘤”的發(fā)現(xiàn),我們推測FoxM1可能是一個可以用于提高外源肝細胞在損傷肝臟中再殖水平的細胞周期因子。因此,本研究選擇FoxMl作為本研究的目的基因,通過在移植肝細胞中過表達FoxM1基因,探討其促進肝細胞肝臟再殖能力的作用。為探討活體內持續(xù)表達FoxMl的肝細胞是否可以增強肝臟再殖的能力,我們首先采用TTR-FoxM1轉基因小鼠模型,獲得FoxM1持續(xù)表達的肝細胞,進行肝臟再殖能力的檢測。然后,將相同數(shù)量的TTR-FoxM1肝細胞和野生型肝細胞分別移植,或通過競爭性再殖實驗混合移植,進入檢驗肝臟再殖的理想模型——FAH基因剔除小鼠(Fah-/-小鼠),在不同時間點分析兩種細胞肝臟再殖的效率。結果顯示,FoxM1持續(xù)表達的TTR-FoxM1肝細胞在相同時間點完成的再殖程度更高,再殖損傷肝臟的能力比野生型肝細胞提高了1.5倍,并且比野生型肝細胞提前2周完成肝再殖。同時,我們將相同數(shù)量的TTR-FoxM1肝細胞和野生型肝細胞移植到2/3肝切的小鼠模型中,在急性肝損傷模型中評價肝臟再殖能力。結果顯示,表達FoxM1的TTR-FoxM1肝細胞的肝臟再殖效率為5%-9%,而野生型肝細胞的再殖效率不超過2%。這些結果表明,活體內FoxM1過表達的肝細胞具有更強的生長和生存優(yōu)勢�；贔oxM1的高表達可以提高肝細胞在活體內再殖肝臟能力的特性,我們進一步探討了如何賦予肝細胞FoxM1高表達特性的技術策略。通過DNA運載系統(tǒng)載體改造野生型肝細胞,從而獲得FoxM1持續(xù)表達的肝細胞,這是開展臨床應用的必經(jīng)途徑。因此,本研究引入能整合基因組并能長期穩(wěn)定表達目的基因的非病毒載體一—Sleeping Beauty (SB)轉座子系統(tǒng),構建了FoxM1 SB載體。在前期工作中,基于Fah-/-小鼠的肝臟再殖特性,我們建立了應用SB載體同時將多個基因導入肝實質細胞的技術體系。根據(jù)前期工作的經(jīng)驗基礎,我們采用液體壓力法將FoxM1 SB載體注射至Fah-/-小鼠尾靜脈,對注射后獲得的FoxM1穩(wěn)定表達的肝細胞進行增殖能力和肝臟再殖能力的分析,從而評價SB轉座子系統(tǒng)傳遞FoxM1基因修飾肝細胞的有效性及穩(wěn)定表達FoxM1肝細胞的增殖能力。我們的研究結果發(fā)現(xiàn),SB載體介導的FoxM1穩(wěn)定表達(SB-FoxM1)的肝細胞與野生型肝細胞相比,在相同時間內肝臟再殖程度更高,與前一部分TTR-FoxM1轉基因小鼠模型的結果相似。通過活體生物熒光成像技術,我們證明了SB-FoxM1穩(wěn)定表達的肝細胞比野生型肝細胞提前2周完成肝再殖。同樣,將SB-FoxM1穩(wěn)定表達的肝細胞移植到2/3肝切急性肝損傷小鼠模型中,能夠實現(xiàn)4%-9%(最高15%)的肝臟再殖。在體外實驗中,體外培養(yǎng)的SB-FoxM1肝細胞比野生型肝細胞具有更高BrdU摻入陽性細胞比例。此外,我們還檢測了兩種細胞中Ki67和PCNA表達,發(fā)現(xiàn)SB-FoxM1肝細胞具有增強的增殖活性。以上實驗結果表明,應用SB載體可有效地傳遞FoxM1基因,穩(wěn)定表達FoxM1的肝細胞的增殖能力增強,在慢性和急性肝損傷模型小鼠中再殖損傷肝臟的能力都較野生型肝細胞有顯著地提升。同時,我們通過直接體外轉染新鮮分離的肝細胞,獲得表達FoxM1的肝細胞,并對其進行肝臟再殖能力的檢測與分析。通過再殖實驗,我們證明了直接體外轉染FoxM1質粒的肝細胞也具有更強的肝臟再殖能力。這種體外修飾成熟肝臟細胞,從而使其獲得更強的肝臟再殖能力的方法具有更大的臨床應用價值。上調細胞周期因子是否會引起組織的異常增生甚至誘發(fā)腫瘤,這是必須考慮的安全性問題。我們通過病理學檢查發(fā)現(xiàn),持續(xù)表達FoxM1細胞移植后再殖的受體肝臟形態(tài)結構正常；通過貫序移植及在體長時間觀測實驗都沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生；通過激光捕獲顯微切割技術獲取FoxM1表達肝細胞移植后重建的受體肝臟組織,進一步檢測腫瘤相關基因表達,發(fā)現(xiàn)在肝細胞中過表達FoxM1沒有誘發(fā)腫瘤形成。這些證據(jù)表明,利用非病毒SB載體調控FoxM1表達的方式可以安全地應用于增強肝細胞增殖能力的研究中。綜上所述,本研究證明了細胞周期調節(jié)因子FoxM1具有增強肝細胞增殖能力和促進肝臟再殖的作用。作為本研究的創(chuàng)新點,我們首次利用非病毒載體傳遞FoxM1基因的技術體系,避免了病毒載體所帶來的內源性病毒重組、插入激活和免疫反應強等不安全因素,這在一定程度上增加了在人類肝臟疾病細胞治療中的實用性。此外,本研究還證明了通過遺傳修飾使FoxM1高表達的肝細胞不會誘發(fā)腫瘤。本研究的開展,為解決移植肝細胞在宿主肝臟內增殖緩慢的問題提供了一個新的思路。
【關鍵詞】：肝細胞移植 FoxM1 肝臟再殖 Sleeping beauty轉座系統(tǒng)
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-19
• 一、肝細胞移植治療的研究現(xiàn)狀13-14
• 二、提高肝細胞移植治療效果的策略14-15
• 三、轉錄因子FoxM1的研究現(xiàn)狀15-19
• 實驗材料19-27
• 一、實驗動物19-20
• 二、儀器與試劑20-27
• 實驗方法27-41
• 一、TTR-FoxM1小鼠肝細胞的分離、移植及肝臟再殖27-31
• 二、通過載體獲得FoxM1持續(xù)表達的小鼠肝細胞31-33
• 三、FoxM1持續(xù)表達的肝細胞的肝臟再殖實驗33-35
• 四、肝細胞增殖和肝再殖能力的檢測35-39
• 五、FoxM1持續(xù)表達的細胞致瘤性的檢測39-40
• 六、統(tǒng)計和分析40-41
• 實驗結果41-63
• 一、持續(xù)表達FOXM1的TTR-FOXM1轉基因小鼠肝細胞具有更強的肝臟再殖能力41-46
• 二、Sleeping Beauty轉座子系統(tǒng)獲得穩(wěn)定表達FOXM1的肝細胞并具有更強的肝臟再殖能力46-59
• 三、小鼠肝臟中持續(xù)表達FOXM1的肝細胞沒有成瘤風險59-63
• 討論63-67
• 一、通過體內轉染或體外轉染能有效上調小鼠肝細胞中FoxM1表達64
• 二、過表達FoxM1的肝細胞能更快完成損傷肝臟的再殖64-65
• 三、肝細胞過表達FoxM1不會誘發(fā)腫瘤65-66
• 四、研究中存在的問題與不足66-67
• 參考文獻67-74
• 綜述74-79
• 參考文獻76-79
• 發(fā)表文章：肝干細胞的幾個生物學問題79-86
• 攻讀博士學位期間發(fā)表和參與發(fā)表的部分論文86-88
• 致謝88-89

【參考文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 金彩霞;肝原始細胞系LEPCs向胰腺β細胞的轉分化潛能研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

  本文關鍵詞：細胞周期因子FoxM1促進肝臟再殖的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：390722