目的骨髓增生異常綜合征（MDS）一種高度異質(zhì)性的髓系腫瘤,約有30%的MDS患者可能進(jìn)展為急性髓系白血病（AML,亦稱sAML）,一旦轉(zhuǎn)變預(yù)后極差。截至目前為止,MDS疾病轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚未完全明確,遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變?cè)谄渲邪缪葜匾饔�。本研究旨在探究MDS轉(zhuǎn)AML中全基因組DNA甲基化改變,同時(shí)篩選和驗(yàn)證驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展相關(guān)的表觀分子,并分析其臨床意義。方法應(yīng)用全基因組簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）分析4例對(duì)照和4例配對(duì)MDS/sAML患者不同階段甲基化態(tài)勢(shì)。同時(shí)應(yīng)用生物信息等方法篩選具有預(yù)后意義和潛在生物學(xué)功能的相關(guān)基因。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR（RQ-MSP）、亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR（BSP）及MethylTarget靶向測(cè)序等方法進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本驗(yàn)證和確定候選基因甲基化改變。實(shí)時(shí)定量PCR（RQ-PCR）及Western Blot（WB）等方法檢測(cè)候選基因的表達(dá)水平。基于臨床標(biāo)本參數(shù)等進(jìn)行臨床意義和預(yù)后分析。同時(shí)通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)候選基因功能。結(jié)果在4例配對(duì)MDS/sAML患者中,隨著疾病進(jìn)展處于sAML階段的全基因組甲基化水平顯著高于MDS階段。MDS階段與... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

ID4基因與人不同惡性腫瘤中相關(guān)性

篩選與鑒定骨髓增生異常綜合征進(jìn)展相關(guān)表觀遺傳學(xué)驅(qū)動(dòng)分子及其臨床意義10圖1.2miR-335通過靶向多種編碼基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過程及信號(hào)通路。[128]1.6DLX5基因1.6.1概述人類DLX同源盒基因主要編碼表達(dá)與胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)與Dll（Distal-less，果蠅無遠(yuǎn)端基因）類似，在發(fā)育中的前腦和顱面結(jié)構(gòu)中表達(dá)[135]。人類有六個(gè)DLX基因，由三個(gè)生物基因簇DLX1/DLX2、DLX3/DLX4和DLX5/DLX6[135]。其中，DLX5位于染色體7q21.3區(qū)域。在正常生理過程中，DLX5和DLX6共同作用，對(duì)于正常顱面，軸向和附肢骨骼發(fā)育都是必需的[136]。本人在碩士期間已經(jīng)對(duì)DLX4進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)髓系腫瘤中DLX4存在高甲基化現(xiàn)象，并且跟MDS和AML患者預(yù)后相關(guān)，與慢性粒細(xì)胞白血病的疾病進(jìn)展相關(guān)[64,137-139]。1.6.2DLX5與腫瘤截止目前為止，針對(duì)DLX5在腫瘤中的作用尚未明確。既往幾篇報(bào)道揭示轉(zhuǎn)錄因子DLX5存在致癌活性。DLX5基因在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌中的過表達(dá)刺激細(xì)胞增殖[140,141]。在小鼠和人類癌細(xì)胞中使用siRNA方法敲減DLX5表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯[140,141]。此外，DLX5對(duì)原癌基因c-myc的表達(dá)有直接影響作用[140]。針對(duì)血液淋系腫瘤，目前只有一篇報(bào)道發(fā)現(xiàn)：DLX5通過直接激活Notch

篩選與鑒定骨髓增生異常綜合征進(jìn)展相關(guān)表觀遺傳學(xué)驅(qū)動(dòng)分子及其臨床意義24圖3.14例配對(duì)MDS/sAML患者中MDS和sAML階段全基因組甲基化程度。檢驗(yàn)方法使用配對(duì)T檢驗(yàn)。3.3.2對(duì)照及配對(duì)MDS/sAML患者差異甲基化分析我們以酶切片段作為分析的基本單元[149-151]，以配對(duì)或者獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)<0.05以及差異性甲基化>25%作為差異性甲基化的條件進(jìn)行初步分析和篩選，定義為差異性甲基化片段（differentiallymethylatedfragments，DMFs）。擬探索參與MDS發(fā)病相關(guān)的甲基化改變，我們通過對(duì)比對(duì)照組與患者M(jìn)DS階段，一共篩選出1090個(gè)DMFs，其中包括441個(gè)高甲基化片段及649個(gè)低甲基化片段，其結(jié)果以熱圖展示（圖3.2）；擬探索參與MDS進(jìn)展相關(guān)的甲基化改變，我們通過對(duì)比配對(duì)患者M(jìn)DS階段與sAML階段，一共篩選出103個(gè)DMFs，其中包括96個(gè)高甲基化片段及7個(gè)低甲基化片段，其結(jié)果以熱圖展示（圖3.2）。此外，我們進(jìn)一步分析了差異性甲基化位點(diǎn)在染色體、CpG島以及基因結(jié)構(gòu)上的定位（圖3.3）。此外，我們進(jìn)一步以CpG島（CGI）、啟動(dòng)子（Promoter）以及基因內(nèi)（Genebody）作為分析的基本單元進(jìn)行差異性分析。針對(duì)CGI，通過對(duì)比配對(duì)患者M(jìn)DS階段與對(duì)照，MDS發(fā)病相關(guān)的候選甲基化改變一共篩選出74個(gè)差異性甲基化CpG島，其中包括37個(gè)高甲基化CpG島及37個(gè)低甲基化CpG島；通過對(duì)比配對(duì)患者M(jìn)DS階段與sAML階段，MDS進(jìn)展相關(guān)的候選甲基化改變一共篩選出32個(gè)差異性甲基化CpG島，均為高甲基化CpG島（圖3.2）。針對(duì)Promoter，通過對(duì)比配對(duì)患者M(jìn)DS階段與對(duì)照，MDS發(fā)病相關(guān)的甲基化改變一共篩選出54個(gè)差異性甲基化Promoter，其中包括22個(gè)高甲基化Promoter及32個(gè)低甲基化Promoter；通過對(duì)比配對(duì)患者M(jìn)DS階段與sAML階段，MDS進(jìn)展相關(guān)的甲基化改變一共篩選出9個(gè)差異性甲基化Promoter，?


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