發(fā)布時間：2017-04-20 11:12

  本文關(guān)鍵詞：PHF19在人肝細(xì)胞癌發(fā)病機制中的作用及其受MiR-195-5p調(diào)節(jié)的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。目前在全球范圍內(nèi),肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原發(fā)性肝癌的70%-85%,在男性癌癥致死率中排名第三位。尤其在亞洲和非洲國家地區(qū),HCC是腫瘤導(dǎo)致死亡的主要因素之一。病程以惡性程度高,發(fā)展較快為特點,已成為嚴(yán)重威脅著人類健康和生命的重要疾病。而對于HCC的發(fā)病機制的研究尚未完全明確,因此,探討HCC的發(fā)病機制將為抗腫瘤治療提供重要的理論依據(jù)。HCC通常是由病毒性感染(如乙肝病毒hepatitis B virus, HBV;丙肝病毒hepatitis C virus, HCV)所導(dǎo)致的肝硬化,酒精濫用,代謝紊亂,致癌物(如亞硝胺),黃曲霉菌等因素發(fā)展而來。HCC具有特異的病原學(xué)和分子學(xué)特征,對治療存在著多樣性反應(yīng)。而多種致癌因素引起的HCC的多樣性特征,可能與基因突變及染色體不穩(wěn)定性所引起的基因?qū)W和表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)。研究證實HCC的發(fā)生是一個多步驟、多基因、多途徑的復(fù)雜階段過程。近年來遺傳基因突變、表觀遺傳學(xué)的改變、信號通路異常激活成為闡述HCC發(fā)病機制中的熱點。其中表觀遺傳學(xué)是指DNA序列本身以外的遺傳信息,一些潛在的表觀遺傳調(diào)控機制,主要有DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA調(diào)節(jié)等。表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容主要包括在基因轉(zhuǎn)錄過程中和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控發(fā)生變化,主要包括DNA甲基化,組蛋白的共價修飾、染色體重塑、非編碼RNA,微小RNA (microRNA, miRNA)等。因此,深入研究HCC發(fā)病機制中的分子生物學(xué)相關(guān)調(diào)控,對明確HCC的診斷及尋找新的治療靶點都具有非常重要的意義。多梳蛋白家族(Polycomb group protein, PcG)是一類在染色質(zhì)水平上通過表觀遺傳修飾作用調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子,PcG通常以多梳蛋白復(fù)合體(Polycomb repressive complex, PRC)的形式存在,目前研究的較多的是多梳蛋白抑制復(fù)合物1(Polycomb repressive complex1, PRC1)和多梳蛋白抑制復(fù)合物2 (Polycomb repressive complex2, PRC2), PRC主要參與表觀遺傳修飾的啟動和維持,進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)。PRC在生物體的不同生長階段中發(fā)揮重要作用,包括細(xì)胞分化、維持細(xì)胞特性、增殖及干細(xì)胞重塑,其主要功能是使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。PHD鋅指蛋白19 (PHD finger protein 19, PHF19)是PRC2中的重要成員之一,有研究認(rèn)為PHF19可通過自身Tudor區(qū)域結(jié)合于H3賴氨酸36位點,參與染色體活化；還有研究表明PHF19在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中同樣具有非常重要的作用,PHF19在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),Ghislin等證明PHF19在黑色素瘤中可減少細(xì)胞增殖率。Li等研究證明PHF19在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞分級呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果都表明,PHF19在不同的腫瘤類型中存在高表達(dá),且與腫瘤的侵襲性有著密切關(guān)系,可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。微小RNA (microRNA, miRNA)是一類長度為17-25個核苷酸的非編碼RNA,通過與信使RNA (messenger RNA, mRNA) 3'UTR端或特異序列結(jié)合,而調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性或抑制其轉(zhuǎn)錄而參與多種生物學(xué)功能。大量研究表明,miRNA參與到許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。改變miRNA水平可引起參與腫瘤生物學(xué)作用的相關(guān)基因發(fā)生變化。近期有研究表明,miR-195在多種腫瘤如肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),在裸鼠中過表達(dá)miR-195可以顯著抑制腫瘤的形成。另有研究表明顯示,miR-195可調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)化并抑制腫瘤的發(fā)生。然而,miR-195與PHF19之間是否存在相互作用,二者是否在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用尚未明確。因此,為探討參與HCC發(fā)生發(fā)展過程中的信號通路的相關(guān)調(diào)節(jié)機制,我們在本課題選擇miR195和PHF19作為研究對象。深入探討其分子生物學(xué)特性,及對肝癌細(xì)胞及組織的功能學(xué)的影響,闡述其具體調(diào)控機制。綜上所述,本課題旨在研究和探討miR-195是否對PHF19有調(diào)控作用,闡述miR-195對HCC發(fā)生發(fā)展過程中分子生物學(xué)機制的影響,主要從細(xì)胞分子水平和動物整體水平觀察PHF 19及調(diào)控其表達(dá)的miRNA對HCC的影響并探討其相關(guān)的機制,為尋找HCC新的治療靶點提供重要依據(jù)。方法一、觀察HCC組織中PHF19的表達(dá)情況1.首先收集30例臨床HCC癌癥組織和配對癌旁組織標(biāo)本,選取癌旁組織為對照組,癌組織為實驗組。對組織進(jìn)行RNA提取,通過實時熒光定量PCR分別檢測30例人HCC癌組織和配對癌旁組織中PHF19 mRNA水平的表達(dá)。二、觀察PHF19對肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響1 通過構(gòu)建PHF19慢病毒過表達(dá)載體,并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中,并利用蛋白印跡實驗(Western blot)對提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,驗證其慢病毒PHF19載體的轉(zhuǎn)染效果。2.觀察的實驗組與對照組的HepG2細(xì)胞通過Transwell膜的數(shù)量,觀察PHF19對肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。3.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-PHF 19 HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞,檢測二者的細(xì)胞增殖效果的差異,觀察PHF19對HepG2細(xì)胞增殖效率的影響。4.對培養(yǎng)的LV-PHF 19 HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞進(jìn)行收集,固定,染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測,觀察PHF19對細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控作用。三、觀察內(nèi)源性miRNA miR-195-5p對PHF19的調(diào)控作用1.通過生物信息學(xué)網(wǎng)站(TargetScan, miRanda, RNA22, miRDB, miR-Gen, PITA, EMBL-EBI, starBase, PicTar, RNAhybrid and miRBase)分析與PHF19特定序列靶向結(jié)合的miRNAs,并通過熒光素酶報告試驗驗證結(jié)合位點。2.在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic,通過蛋白印跡實驗(Western blot)檢測PHF19蛋白水平表達(dá)情況。3.通過收集30例臨床HCC病人癌組織和配對癌旁組織標(biāo)本,利用RT-RCR檢測組織中miR-195-5p表達(dá)情況。四、觀察miR-195-5p對肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響1.通過構(gòu)建miR-195-5p慢病毒過表達(dá)載體,并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中。用Transwell小室觀察過表達(dá)miR-195-5p HepG2的處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞的侵襲及遷移作用的差異。觀察miR-195-5p對HepG2細(xì)胞侵襲性的影響。2.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-miR-195-5p HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞,檢測二者的細(xì)胞增殖率的差異,觀察miR-195-5p對HepG2細(xì)胞增殖效率的影響。3.對培養(yǎng)的LV-miR-195-5p HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞進(jìn)行收集,固定,染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測,觀察miR-195-5p對細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控作用。五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸鼠成瘤作用的影響1.分別將處理組LV-PHF19HepG2細(xì)胞、LV-miR-195-5p細(xì)胞HepG2,對照組LV-Mock HepG2細(xì)胞配置成細(xì)胞懸液,注射到裸鼠體內(nèi),喂養(yǎng)并每3天稱重,2周后解剖腫瘤組織進(jìn)行稱重,觀察PHF19及miR-195-5p的對成瘤效果的影響。六、統(tǒng)計學(xué)分析所有計量資料結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。qPCR檢測PHF19在HCC癌組織和配對癌旁組織實驗和裸鼠成瘤實驗結(jié)果采用配對的t檢驗,對細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期影響的實驗結(jié)果采用析因設(shè)計的方差分析,對PHF19蛋白表達(dá)結(jié)果采用單因素方差分析,其它的兩兩比較的結(jié)果采用獨立樣本t檢驗；采用SPSSv13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計結(jié)果以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、觀察HCC癌組織中PHF19的表達(dá)情況1.收集南方醫(yī)院臨床30例肝癌癌癥組織和配對癌旁組織標(biāo)本,選取癌旁組織為對照組,癌組織為處理組。提取組織RNA,通過RT-PCR分別檢測組織中PHF19的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,PHF19在癌組織表達(dá)顯著上調(diào)(t=-3.909,P=0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。二、觀察PHF19對肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響1.本研究通過構(gòu)建過表達(dá)PHF19的慢病毒包裝質(zhì)粒載體,并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,同時設(shè)立實驗組LV-PHF19 HepG2細(xì)胞及對照組LV-Mock HepG2細(xì)胞,提取轉(zhuǎn)染PHF19的肝癌細(xì)胞株中的總蛋白,并利用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)對提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果驗證,結(jié)果顯示：PHF19過表達(dá)的肝癌細(xì)胞組轉(zhuǎn)染效果顯著高于對照組,組間對比有顯著性差異(F=50.43,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。2.利用經(jīng)典的Transwell小室實驗,觀察穩(wěn)定過表達(dá)PHF19的肝癌細(xì)胞株侵襲性是否受到增強。結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,穩(wěn)定過表達(dá)PHF19后肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力都顯著增強,組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(invasion: t=-8.736,P0.001; migration:t=-20.476, P0.001)。3.通過CCK-8增殖實驗,我們發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,過表達(dá)PHF19可提高肝癌細(xì)胞的增殖能力,24小時(F=13.958,P=0.001)和48小時(F=20.582,P0.001)細(xì)胞增殖能力都顯著增高,有統(tǒng)計學(xué)意義。4.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PHF19過表達(dá)后對肝癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果顯示,與LV-Mock HepG2細(xì)胞相比,LV-PHF19 HepG2細(xì)胞處于G1期細(xì)胞數(shù)目減少(F=263.311,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義；處于S期細(xì)胞數(shù)目增多(F=249.19,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義；而G2M期無顯著性差異(F=0.175,P=0.679),沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同時凋亡檢測結(jié)果顯示：與LV-Mock HepG2細(xì)胞相比,LV-PHF19 HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比率明顯減少(t=-11.724,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。表明PHF19在HCC病理過程中具有重要作用。三、觀察調(diào)控肝癌過程中PHF19的內(nèi)源性miRNA1.為進(jìn)一步研究與PHF19結(jié)合的miRNA,我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站(TargetScan, miRanda,RNA22, miRDB, miR-Gen, PITA, EMBL-EBI, starBase, PicTar, RNAhybrid and miRBase)分析與PHF19靶向結(jié)合的miRNAs,并通過熒光素酶報告實驗驗證結(jié)合位點,結(jié)果顯示PHF19的3'UTR與miR-195-5p區(qū)存在互補配對序列。2.在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染has-miR-195-5p mimic,通過蛋白印跡實驗(Western blot)檢測PHF19蛋白水平表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,has-miR-195-5p可明顯下調(diào)PHF19的蛋白水平表達(dá),兩組有統(tǒng)計學(xué)差異(F=32.033,P0.001)。3.對所收集臨床30例HCC病人癌組織和配對癌旁組織標(biāo)本,提取其RNA,利用RT-RCR檢測miR-195-5p基因水平表達(dá)情況,結(jié)果顯示癌組織中miR-195-5p表達(dá)顯著低于對照組(t=6.67,P=0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。驗證了miR-195-5p與PHF19表達(dá)呈相反變化趨勢。四、觀察miR-195-5p對肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響1.構(gòu)建miR-195-5p慢病毒過表達(dá)載體,并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞HepG2中。通過Transwell實驗,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,過表達(dá)miR-195-5p可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲(t=11.490,P0.001)和轉(zhuǎn)移能力(t=11.355,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。2.增殖實驗結(jié)果顯示,相對于對照組,過表達(dá)miR-195-5p后24小時HepG2細(xì)胞的增殖活力(F=13.489,P=0.001)和48小時(F=16.988,P=0.000)細(xì)胞增殖能力均有顯著下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.過表達(dá)miR-195-5p后,與對照組細(xì)胞相比,處于G1期細(xì)胞增多(F=37.759,P=0.000),處于S期細(xì)胞減少(F=32.710,P=0.000),均有顯著性差異,有統(tǒng)計學(xué)意義。凋亡檢測結(jié)果顯示：與對照組細(xì)胞相比, LV-has-miR-195-5p HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著增加(t=11.728,P0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸鼠成瘤作用的影響1.與體外細(xì)胞實驗結(jié)果相一致,體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明,注射表達(dá)慢病毒空載載體肝癌細(xì)胞的對照組中裸鼠體內(nèi)瘤塊并未明顯變化,而注射PHF19過表達(dá)的肝癌細(xì)胞成瘤作用顯著高于對照組(t=6.14,P0.001),注射miR-195-5p過表達(dá)組肝癌細(xì)胞則成瘤作用顯著低于對照組(t=-4.552,P0.001),均有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明：PHF19具有成瘤作用,而miR-195-5p具有抑瘤作用。結(jié)論1.PHF19在肝癌組織中表達(dá)明顯高于配對癌旁組織,與肝癌發(fā)展相關(guān)。2.過表達(dá)PHF19可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和生長,并抑制細(xì)胞凋亡;3.miR-195-5p通過靶向調(diào)控PHF19的轉(zhuǎn)錄,并下調(diào)PHF19的表達(dá)；4. miR-195-5p在肝癌組織中表達(dá)明顯低于配對癌旁組織,過表達(dá)miR-195-5p可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和生長,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；5.動物實驗證實PHF19在肝癌中具有成瘤作用,miR-195-5p則具有抑瘤作用。創(chuàng)新點設(shè)計具有PHF19差異表達(dá)的細(xì)胞,檢測其對細(xì)胞功能學(xué)的影響,首次證實了過表達(dá)PHF19具有明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和生長的能力。通過生物信息學(xué)預(yù)測,首次發(fā)現(xiàn)能靶向作用于PHF19的是miR-195-5p。設(shè)計具有miR-195-5p差異表達(dá)的細(xì)胞,檢測其對PHF19表達(dá)的影響,并證實miR-195-5p對細(xì)胞增殖及生長的抑制作用是通過靶向抑制PHF19表達(dá)而實現(xiàn)。通過體外細(xì)胞和體內(nèi)動物成瘤實驗,證實了受腫瘤抑制因子miR-195-5p所調(diào)節(jié)的PHF19具有促進(jìn)HCC發(fā)生的作用。這些研究將進(jìn)一步說明miR-195-5p和PHF19有望作為HCC的治療靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：PHF19 miR-195-5p HCC 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-37
• 材料和方法37-58
• 1 實驗材料37-39
• 2 實驗方法39-57
• 3 統(tǒng)計學(xué)分析57-58
• 實驗結(jié)果58-79
• 1 PH19對肝癌細(xì)胞功能的影響58-59
• 2 PHF19對肝癌細(xì)胞生長的影響59-66
• 3 miRNA-195-5p對PHF19表達(dá)影響的研究66-70
• 4 miR-195-5p對肝癌細(xì)胞功能的影響70-77
• 5 PHF19和miRNA-195-5p對裸鼠肝癌形成的機制研究77-79
• 討論79-91
• 全文小結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-110
• 附錄110-111
• 縮略詞簡表111-113
• 致謝113-116
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明116

  本文關(guān)鍵詞：PHF19在人肝細(xì)胞癌發(fā)病機制中的作用及其受MiR-195-5p調(diào)節(jié)的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：318540