發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 15:35

　　 甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是有包膜的、負(fù)義、單鏈RNA病毒,常引起季節(jié)性流感,新型IAV具有引起流感大流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)。IAV首先通過病毒表面蛋白HA與細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合而侵入呼吸道或肺上皮細(xì)胞,病毒感染的結(jié)果取決于病毒復(fù)制和宿主免疫反應(yīng)之間的平衡。IAV感染引起炎癥反應(yīng)的過度激活會導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá),形成的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”被認(rèn)為是IAV感染機(jī)體誘導(dǎo)肺部炎癥和引起致病性的重要原因。正常細(xì)胞朊蛋白(Normal Cellular Prion Protein,PrP~c)是一種細(xì)胞表面膜糖蛋白,在腦中表達(dá)最豐富,肺次之。PrP~c參與神經(jīng)保護(hù)、免疫反應(yīng),并在各種病毒感染中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。最新研究表明PrP~c通過抗氧化應(yīng)激能夠發(fā)揮抗IAV病毒感染的作用,其機(jī)制是通過PrP~c N末端OR區(qū)與Cu~(2+)結(jié)合,進(jìn)一步調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生酶(Superoxide Dismutase,SOD1)的活性,降低細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)小鼠免受IAV的致死性感染。然而,PrP~c的非OR區(qū)(除了OR區(qū)以外的功能域)是不是也具有抗病毒感染的作用,目前尚未有文獻(xiàn)深入探討。此外,PrP~c能夠在T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞,以及Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管Clara細(xì)胞中表達(dá),因此PrP~c可能在肺部的免疫系統(tǒng)中扮演重要角色。IAV感染肺上皮細(xì)胞,直接或間接誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,但是PrP~c在IAV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中到底發(fā)揮哪些重要作用尚不清楚。基于此,本論文通過PrP~c兩種基因敲除小鼠及PrP~c過表達(dá)質(zhì)粒分別在體內(nèi)和體外兩個(gè)層次探討其在IAV感染及炎性反應(yīng)中的作用,并借助RNA-Seq測序、差異基因表達(dá)譜的分析和驗(yàn)證,進(jìn)一步探討其中的分子機(jī)制。主要研究內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.從體內(nèi)水平研究PrP~c對小鼠致病性的影響。首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建兩類PrP~(-/-)小鼠,分別是朊蛋白全基因敲除小鼠(119KO)和朊蛋白OR區(qū)敲除小鼠(120KO),比較野生型小鼠(WT)與PrP~(-/-)基因敲除小鼠(119KO和120KO)在H7N7-IAV感染后3、5、8、11天時(shí)的臨床癥狀和肺組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明,與WT小鼠相比,120KO小鼠更容易感染H7N7病毒,即小鼠存活率降低,體重下降明顯以及肺部病理損傷更嚴(yán)重;而PrP~c全基因敲小鼠(119KO)不易感染H7N7病毒,即臨床癥狀及肺組織病理學(xué)變化均輕于野生型小鼠。因此,我們推測朊蛋白在病毒感染的過程中具有雙重調(diào)節(jié)作用,即朊蛋白OR區(qū)可能具有抗流感病毒感染,保護(hù)機(jī)體,減輕機(jī)體損傷的作用,而PrP~c非OR區(qū)可能對于病毒感染具有促進(jìn)作用。2.對病毒感染后3、5、8、11天的120KO、119KO、WT小鼠和生理鹽水對照組小鼠的肺組織進(jìn)行RNA-seq分析與q-PCR驗(yàn)證,進(jìn)一步探討PrP~c在IAV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明,H7N7感染小鼠肺后能夠誘導(dǎo)大量細(xì)胞炎癥因子表達(dá),如TLRs通路基因(如TLR4/7/3、MyD88、TAK1、IRF3)、干擾素(IFNα/β和IFNγ)、IL6、TNFα、Nrf2和兩類趨化因子及其受體(CCL2/3/11和受體CCR2/3,CXCL2/3/10/11和受體CXCR3/4/6)。與野生型WT小鼠相比,大部分細(xì)胞因子和趨化因子在120KO小鼠中的表達(dá)量顯著升高,而在119KO小鼠中顯著降低。因此我們認(rèn)為OR區(qū)能夠抑制細(xì)胞因子和趨化因子在H7N7感染后的上調(diào)表達(dá),在IAV感染誘導(dǎo)的炎癥風(fēng)暴中發(fā)揮保護(hù)作用;而PrP~c的非OR區(qū)可能促進(jìn)了炎癥因子上調(diào)表達(dá),即增強(qiáng)H7N7-IAV感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。綜上所述,朊蛋白的不同功能域在H7N7-IAV感染小鼠的肺損傷及炎癥反應(yīng)中可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。3.通過PrP~c過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細(xì)胞(MLE-12),進(jìn)一步驗(yàn)證PrP~c在流感病毒H7N7感染中的作用。結(jié)果表明,在H7N7侵染細(xì)胞后的不同時(shí)期,病毒與PrP~c互相作用的結(jié)果不同:感染早期(12h),病毒誘導(dǎo)PrP~c上調(diào)表達(dá);感染24h后,PrP~c的表達(dá)顯著下降,并能持續(xù)下調(diào)病毒M基因的表達(dá);感染48h后,PrPc的表達(dá)又開始升高。轉(zhuǎn)染24h后,過表達(dá)的PrP~c誘導(dǎo)了MLE-12細(xì)胞中的IFN-β和TLR3顯著上調(diào),但當(dāng)病毒感染后,過表達(dá)的PrP~c顯著降低了IFN-β表達(dá),升高了TLR3的表達(dá),該結(jié)果與120KO小鼠中表達(dá)趨勢一致。因此,在IAV感染過程中,PrP~c對不同的細(xì)胞因子可能有不同的調(diào)節(jié)作用。綜上所述,本研究首次揭示了朊蛋白在IAV病毒感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用,為朊蛋白作為抗流感的分子靶標(biāo)研究提供了重要依據(jù)。另外,我們也首次對朊蛋白不同功能域所發(fā)揮的作用進(jìn)行了探討,進(jìn)一步拓展了對PrP~c生理功能的認(rèn)識。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R511.7
【部分圖文】：

趨化因子是由許多小分泌蛋白組成的大家族,由40多種趨化型細(xì)胞因子組成,可由多種細(xì)胞分泌,趨化因子作為免疫細(xì)胞的趨化劑發(fā)揮作用,控制白細(xì)胞在體內(nèi)的遷移并招募促炎性細(xì)胞(噬中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、噬酸性粒細(xì)胞等)[16]。趨化因子的生物學(xué)效應(yīng)是通過與這些細(xì)胞表面的特異性G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、促炎細(xì)胞通過血管遷移到炎癥部位[17]。根據(jù)趨化因子N端半胱氨酸的基序,它們由CC和CXC(α類),XC(γ類)和CX3C(δ類)趨化因子[18,19]四類組成,包括調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的因子RANTES(CCL5配體),單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)MCP-1、MCP-3,巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP-1α),干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)和白介素8(IL-8),促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子α(TNF-α)和抗病毒細(xì)胞因子IFNα/β[13],圖1-1展示了IAV感染上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子。在炎癥早期,促炎性細(xì)胞因子發(fā)揮作用,細(xì)胞因子像信號彈一樣,招募免疫細(xì)胞參與免疫反應(yīng),被激活的免疫細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子,并繼續(xù)招募更多的細(xì)胞,產(chǎn)生更多細(xì)胞因子[20,21]。由此可見,炎癥反應(yīng)是隨著細(xì)胞因子信號的增強(qiáng)而不斷放大的。值得注意的是,炎癥是一把雙刃劍。一方面,炎癥反應(yīng)可以清除病原,促進(jìn)損傷組織細(xì)胞修復(fù),維護(hù)機(jī)體環(huán)境;另一方面,免疫細(xì)胞在打擊病原體的過程中,不具有特異性,釋放的殺傷性物質(zhì)也會損傷正常組織[22]。促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子同時(shí)在體內(nèi)發(fā)揮作用,就有可能造成一種極度復(fù)雜的免疫功能紊亂。在加重炎癥反應(yīng)的同時(shí),也會使得機(jī)體對病原體的識別和吞噬功能減弱,引起機(jī)體免疫防御能力下降[23]。

干擾素IFN是免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一,名字源于其干擾病毒復(fù)制的能力。目前,根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生的活性,已經(jīng)識別出I型和II型IFN。I型IFN主要在調(diào)節(jié)自然免疫中發(fā)揮作用,II型IFN主要協(xié)調(diào)細(xì)胞免疫。IFNγ屬于II型IFN,由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌,具有多種功能。IFNα和IFNβ屬于I型IFN,分別由淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌。IFNα/β是直接的抗病毒介質(zhì),并具有抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性[16,37],通常在病毒感染后數(shù)小時(shí)內(nèi)被誘導(dǎo)激活,可以上調(diào)趨化因子MCP-1、MCP-3和IP-10的表達(dá),誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th1型細(xì)胞進(jìn)一步募集到感染部位[38]。IFNα/β與被感染細(xì)胞和鄰近細(xì)胞表面的共同受體(IFNAR)相互作用,通過多條級聯(lián)反應(yīng)信號通路誘導(dǎo)數(shù)百種基因(IFN刺激基因,ISGs)的轉(zhuǎn)錄,包括包括RIG-I、Mda5、IRF7、TLR3/7、STAT1[39],以及抑制病毒復(fù)制的蛋白編碼基因[40]。此外,IFN自身通過正反饋回路觸發(fā)誘導(dǎo)IFN表達(dá)的蛋白,如RIG-I、IKK3、STAT等的表達(dá)。而IFN刺激的基因ISGs通過各種機(jī)制抵消IAV的復(fù)制和傳播[39],暗示了ISG抗病毒反應(yīng)的正反饋機(jī)制。其中一些通路在圖1-2中展示。自1918年20世紀(jì)第一個(gè)有記錄的流感大流行開始,流感病毒通過突變和重組而顯示出高遺傳和抗原多樣性,逐步表現(xiàn)出適應(yīng)哺乳動物宿主的重要變化[41]。IAV的分布廣泛性和宿主多樣性使它們能夠適應(yīng)包括人類在內(nèi)的不同鳥類和哺乳動物宿主。近年來,已經(jīng)出現(xiàn)新的AIV具有跨越動物-人的物種屏障并在人類中引起輕度或致命的并發(fā)癥,存在形成新的更易感染人類的病毒亞型并在人群中傳播的風(fēng)險(xiǎn);隨著IAV獲得對目前可用的抗流感藥物如病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑的抵抗力,因此,尋找新的抗流感藥物的靶分子變得尤為迫切。

代替核酸,PrPsc蛋白質(zhì)成為能夠自我復(fù)制的病原體,從根本上改變了“傳染性”的概念[51]。PrPsc是PrPc的異常構(gòu)象,主要結(jié)構(gòu)由α螺旋轉(zhuǎn)變成β折疊[52,53]),PrPsc能夠形成緊密的、不溶性、蛋白酶耐受的蛋白聚集體在腦中積累[54],并且對經(jīng)典病原體滅活程序不敏感。PrPsc轉(zhuǎn)化為PrPc已經(jīng)有幾種模型和假說,最基本的解釋是感染過程中PrPsc將PrPc轉(zhuǎn)化為PrPsc并引起一些突變,使得蛋白變得不穩(wěn)定[55],后者的結(jié)合會使PrPc繼續(xù)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致PrPsc進(jìn)一步積累[56,57](見圖1-3)。這一假說同朊蛋白突變體的進(jìn)展性和Prnp敲除小鼠對患瘙癢癥羊腦提取物的抗感染性狀一致[57]。病原體(圖1-3亮綠色)感染正常PrPc蛋白(叉狀)發(fā)生構(gòu)像變化,而進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)。異常異構(gòu)體整合到β折疊構(gòu)成的蛋白(不斷增長的藍(lán)色片狀)中,破壞α螺旋結(jié)構(gòu)。功能獲得性假說的基本原則是PrPsc聚集會使神經(jīng)元對程序性細(xì)胞凋亡敏感并誘發(fā)病毒性疾病[58]。功能喪失假說則是,PrPc的喪失會導(dǎo)致細(xì)胞脆弱和病毒性疾病[59]。兩種假說并非互相排斥,但PrPsc積累、細(xì)胞凋亡和疾病發(fā)生之間的相互依賴性關(guān)系依然有待解決。1.3.2 朊蛋白的結(jié)構(gòu)與生理功能
【參考文獻(xiàn)】

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1 Bryon Ellis;Leah Kaercher;Courtney Snavely;;Lipopolysaccharide triggers nuclear import of Lpcat1 to regulate inducible gene expression in lung epithelia[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年07期

2 Peter C Konturek;Karolina Bazela;Vitally Kukharskyy;Michael Bauer;Eckhart G Hahn;Detlef Schuppan;;Helicobacter pylori upregulates prion protein expression in gastric mucosa: A possible link to prion disease[J];World Journal of Gastroenterology;2005年48期

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1 賈燕青;新城疫病毒感染雞胚miRNAs和mRNAs表達(dá)譜分析與抗病毒基因的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

2 薛瑞雪;貂源H9N2亞型流感病毒對小鼠致病性與宿主hnRNP H1抑制流感病毒復(fù)制機(jī)理研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2865738