砷元素是地殼中的常見化學(xué)元素之一,對人類的健康具有一定程度的危害。砷元素的無機(jī)形態(tài),尤其是三價氧化態(tài)的亞砷酸鈉(NaAsO_2)和三氧化二砷(As2O3)等的毒性很強(qiáng)。以往的研究表明,長期攝入砷元素含量超標(biāo)的飲用水會增加罹患皮膚癌、肺癌、肝癌、腎癌在內(nèi)的多種類型癌癥的發(fā)病風(fēng)險。此外,人體接觸砷元素還會引發(fā)如Bowen’s病、色素沉著異常等在內(nèi)的多種皮膚損傷。值得注意的是,砷暴露引發(fā)的皮膚損傷具有5-10年的潛伏期,且在砷暴露停止后的數(shù)十年內(nèi)相關(guān)的疾病仍舊會進(jìn)一步加重,提示對于砷元素的毒性需要長期預(yù)防。當(dāng)砷元素進(jìn)入機(jī)體后,能夠引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致活性氧(ROS)升高、細(xì)胞活力下降、引發(fā)DNA損傷及細(xì)胞突變、細(xì)胞凋亡。Nrf2是細(xì)胞維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和對抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能夠調(diào)節(jié)包括血紅素氧合酶1(HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、醌氧化還原酶1(NQO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)在內(nèi)的多種抗氧化酶的表達(dá)。有研究表明,Nrf2在細(xì)胞抗無機(jī)砷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,Nrf2的激活及其調(diào)節(jié)的細(xì)胞抗氧化物質(zhì)可以保護(hù)Ha Ca T細(xì)胞免受砷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性損傷。因此,激活Nrf2的表達(dá)是對抗砷誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。一些前期研究證明了天然化合物紫檀芪(Pterostilbene,Pts)具有優(yōu)秀的抗氧化作用。紫檀芪可以降低包括過氧化氫和超氧陰離子在內(nèi)的活性氧活性;可以使得不同細(xì)胞系過氧化氫酶的表達(dá)增加,如總谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶,超氧化物歧化酶等。紫檀芪可能通過激活Nrf2等多個相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制發(fā)揮其抗氧化作用。通過抗氧化作用,Pts能夠調(diào)節(jié)并改善靶細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激水平,保護(hù)細(xì)胞免于各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、壞死等細(xì)胞損傷。因此,在這項研究中,我們通過細(xì)胞活性試驗研究了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用;通過DCFH-DA熒光檢測方法檢測了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的緩解作用;通過檢測細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)水平,測定了Pts的抗氧化作用;通過JC-1法檢測線粒體膜電位水平研究了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的線粒體損傷的保護(hù)作用;通過免疫印跡法檢測了Pts對細(xì)胞色素C(Cytochrome C)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。之后,在體內(nèi)試驗中,我們給予小鼠自由飲用含有NaAsO_2的飲水進(jìn)行染毒,之后給予不同劑量的Pts對小鼠進(jìn)行治療,通過檢測小鼠在實驗期間的體重變化、臟器系數(shù)變化、肝臟及皮膚的病理組織學(xué)變化、脾臟及胸腺淋巴細(xì)胞亞群的變化等指標(biāo),研究了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的小鼠亞慢性砷中毒模型的保護(hù)作用;進(jìn)一步,我們通過研究Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)線粒體功能和凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用確定了Pts的作用靶點(diǎn);最后通過si RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低了Nrf2的表達(dá),研究了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明:Pts在受試濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞活力無顯著影響,但對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有極顯著的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Pts可以降低由NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高、降低NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)MDA水平、提高細(xì)胞內(nèi)的SOD水平、降低線粒體膜電位去極化率、抑制NaAsO_2誘導(dǎo)的線粒體中細(xì)胞色素C(Cytochrome C)向胞質(zhì)部分的釋放、顯著抑制NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死,進(jìn)而對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。體內(nèi)試驗中,我們發(fā)現(xiàn)Pts能夠緩解NaAsO_2染毒后造成的小鼠增重下降及小鼠肝臟系數(shù)下降、緩解NaAsO_2染毒后造成的小鼠肝臟損傷及皮膚角質(zhì)化,并顯著逆轉(zhuǎn)NaAsO_2染毒造成的小鼠脾臟及胸腺淋巴細(xì)胞CD4/CD8的比值下降,保護(hù)小鼠的免疫功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Pts可誘導(dǎo)腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)和AKT磷酸化,使Nrf2從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,上調(diào)Nrf2下游NQO1和HO-1的表達(dá);Pts可以上調(diào)NaAsO_2抑制的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達(dá),下調(diào)NaAsO_2激活的促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bad和Caspase 3的蛋白表達(dá)。在Nrf2敲低的細(xì)胞中,Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性及ROS生成的抑制作用大幅減弱,說明Nrf2是Pts發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵蛋白,Pts通過激活Nrf2途徑發(fā)揮對NaAsO_2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了Pts對NaAsO_2誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用,能夠緩解NaAsO_2染毒對小鼠造成的危害,保護(hù)小鼠的免疫功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Nrf2是Pts發(fā)揮上述作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,Pts通過激活Nrf2信號通路并調(diào)節(jié)抗氧化物質(zhì)的表達(dá),從而保護(hù)細(xì)胞免于NaAsO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。我們的研究對Pts的抗氧化作用提供了研究基礎(chǔ)。Pts在預(yù)防和治療由砷暴露引起的皮膚損傷和其他疾病方面具有潛在的應(yīng)用價值。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Nrf2由nuclear factor,erythroid-derived 2-like 2(NFE2L2)基因編碼,含有6個結(jié)構(gòu)域(圖2.1)[86],其中Neh1區(qū)域含有一個堿性亮氨酸拉鏈(basic region-leucine zipper,bZIP),當(dāng)Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),bZIP有助于Nrf2與小Maf蛋白(small Maf proteins,sMafs)形成二聚體,并能夠幫助Nrf2識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant-response-element,ARE),進(jìn)而啟動下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Neh2及Neh6是降解決定子,其中,Neh2含有兩個保守的區(qū)域DLGex和ETGE,是Nrf2與Keap1的結(jié)合區(qū),有助于Nrf2與Keap1的結(jié)合,并幫助Nrf2穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中不被降解;而Neh6是Nrf2與β-TrCP的結(jié)合區(qū)。Neh3位于C端,與ARE對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過程相關(guān)。Neh4和Neh5區(qū)是參與啟動下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域,當(dāng)Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),需要Neh4及Neh5負(fù)責(zé)激活Nrf2依賴的轉(zhuǎn)錄過程[87-89]。作為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑,Nrf2的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。在健康條件下,Nrf2的mRNA持續(xù)表達(dá),使得Nrf2的表達(dá)控制在蛋白水平[90]。蛋白翻譯之后,Nrf2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,和Kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)結(jié)合,形成抑制自身活性的復(fù)合物。當(dāng)受到外界因素(如親電子物質(zhì)或者ROS等)刺激時,刺激因素修飾Keap1的半胱氨酸殘基,使得Keap1的空間構(gòu)象發(fā)生改變,進(jìn)而使得Nrf2-Keap1的復(fù)合物發(fā)生解離,釋放出Nrf2[91]。Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核以后,和ARE結(jié)合,繼而激活下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)產(chǎn)生一系列抗氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì),有助于細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷[92]。

Nrf2在調(diào)節(jié)線粒體功能中具有重要作用。研究表明,Nrf2參與線粒體膜電位的調(diào)節(jié)以及ATP的合成。在一份來自于原代小鼠肝臟細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究中,Nrf2的激活能夠調(diào)節(jié)ATP合酶α亞基的表達(dá)[106]。在氧化應(yīng)激條件下,Nrf2介導(dǎo)的解偶聯(lián)蛋白3的表達(dá)能夠提高線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子傳導(dǎo)率,從而減少超氧化物的形成[107]。當(dāng)Nrf2缺失時,蘋果酸酶1、異檸檬酸脫氫酶1、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶的表達(dá)降低,進(jìn)而導(dǎo)致NADPH的表達(dá)水平降低。HADPH的表達(dá)水平降低進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫�原性谷胱甘肽的效率降低,導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化為氧化態(tài),最終引起炎癥及細(xì)胞死亡[108,109]。Nrf2在線粒體的生物發(fā)生過程中也很重要。有研究表明,在缺乏Nrf2的肝臟細(xì)胞中,線粒體DNA的數(shù)量明顯低于野生型細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA的數(shù)量[110]。此外,Nrf2對于線粒體的完整性具有調(diào)控作用,研究發(fā)現(xiàn),通過給予Nrf2激活劑蘿卜硫素處理,能夠保護(hù)大鼠腦部來源的線粒體免于過氧化物誘導(dǎo)的線粒體通透性的增加,且這一保護(hù)作用與蘿卜硫素作用下的線粒體谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶1、蘋果酸酶3和硫氧還蛋白2的增加密切相關(guān)[111,112]。在動物體內(nèi),敲除nrf2基因的小鼠雖然能夠正常發(fā)育,但是對外界氧化性刺激的敏感性大幅提高,提示Nrf2在小鼠抗氧化應(yīng)激過程中扮演關(guān)鍵角色[113,114]。最后,在氧化應(yīng)激過程中,Nrf2也能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬體的降解作用來清除受損的線粒體,充分說明了Nrf2在線粒體調(diào)控中具有重要的作用[115,116]。

紫檀芪(Pterostilbene,Pts)是一種多酚類化合物,屬于白藜蘆醇的二甲基化衍生物,主要存在于藍(lán)莓、葡萄、花生、紫檀等植物中,相較于其同系物白藜蘆醇,Pts具有更高的親脂性、更好的生物利用度及更優(yōu)秀的生物學(xué)活性[124-127]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Pts具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種有益于人體健康的生物學(xué)活性,是天然化合物抗氧化研究的熱點(diǎn)[128-141]。3.1 紫檀芪的藥理作用
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本文編號：2858573