本文關鍵詞：miR-335-5p在腎癌中的抑癌作用及其分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：腎癌又稱腎細胞癌(renal cell carcinoma RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱癌,。腎癌對放療及化療均不敏感,手術切除仍是目前最佳的治療手段,但術后復發(fā)率約為20%-40%。由于腎癌的化療及放療抵抗性,臨床上沒有有效的術后治療手段。目前的研究仍然對腎癌的發(fā)生以及進展的機制缺乏足夠深入的理解。探索腎癌的發(fā)生發(fā)展分子機制,尋找有效的診斷、預后分子標志物及分子治療靶點,具有重要的意義。miRNA是一類長度約為20-24個核苷酸的由內源基因編碼的非編碼RNA單鏈分子。越來越多的研究證明這些普遍存在的非編碼小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。miRNA的表達水平具有分化的時序性和位相性。對于各類疾病,尤其是腫瘤而言,miRNA也出現(xiàn)了時間和空間上的表達異常,本研究希望在腎癌中尋找可能的異常表達,并發(fā)現(xiàn)其在基因調控中所扮演的作用。目的：在收集的腎癌患者手術切除的標本組織中采用熒光定量PCR的方法檢測miR-335-5p的表達情況,分析影響miRNA表達水平的表觀遺傳機制。以獲得性功能實驗觀察miR-335-5p在腎癌細胞系786-O, ACHN和Caki-1中的生物學功能。并且根據生物信息學知識,對潛在的miR-335-5p作用靶點進行驗證,并通過靶點分子的沉默和過表達實驗,證實miR-335-5p對靶點的調控意義,探索可能存在的分子調控機制。方法：1.在25對配對的腎癌組織標本檢測miR-335-5p的相對表達量,統(tǒng)計分析miR-335-5p在腎癌及癌旁腎臟組織中的表達差異,并分析不同病例級別與分期的腎癌中miR-335-5p的表達情況；2.通過體外轉染miR-335-5p模擬體(mimic)的方式來進行獲得性功能實驗。通過CCK-8、平板克隆形成、Transwell小室法和流式細胞周期檢測等手段來分析上調miR-335-5p的表達對細胞增殖及遷移侵襲能力帶來的影響；3.結合在線生物信息學工具對miR-335-5p進行靶基因預測,然后利用Real Time PCR, Western Blot等驗證靶基因mRNA以及蛋白表達量的變化,并利用熒光素酶雙報告系統(tǒng)對miR-335-5p的靶序列進行鑒定,并使用RNA干擾、質粒過表達拯救實驗等進一步證實靶向調控關系。結果：1.在收集的25例腎癌組織標本中,有19例為miR-335-5p相對低表達,占76%。癌組織中]miR-335-5p表達量平均約為癌旁組織的1/10。2.腎癌細胞系786-0,ACHN和Caki-1及22例腎癌組織中miR-335-5p啟動子區(qū)CpG島較癌旁正常組織呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài),提示DNA甲基化可能與miR-335-5p在腎癌中的低表達有關。3.體外轉染miR-335-5p mimic至腎癌786-0, ACHN和Caki-1細胞株從而過表達miR-335-5p,可以抑制其生長。并且其抑制率呈現(xiàn)時間與濃度依賴性,在50nMmiR-335-5p mimic處理72小時后,其抑制率可達到30-40%(p0.05)。流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)50nM miR-335-5p mimic作用48小時后可以誘導三種腎癌細胞發(fā)生G1期阻滯,而流式細胞凋亡檢測提示miR-335-5p過表達并不能誘導細胞凋亡。miR-335-5p過表達可以抑制腎癌細胞體外克隆形成能力。Transwell小室實驗提示miR-335-5p過表達不能抑制腎癌細胞的侵襲和遷移能力。4.成功構建裸鼠的皮下荷Caki腫瘤模型。瘤內給予脂質體包裹的miR-335-5p,觀察到移植瘤的生長受到明顯抑制,同時檢測到瘤組織中增殖相關蛋白Ki67和p-Rb表達下調。5.通過在線軟件的分析,將序列比對程序分析結果與細胞表型變化相結合,預測CDK2、CCNE2可能是miR-335-5p的靶基因,同時通過Real-time RT-PCR和Western Blot實驗檢測到CDK2和CCNE2在過表達miR-335-5p后mRNA水平和蛋白水平都有下調。進一步熒光素酶報告系統(tǒng)分析證實CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶點,其3'-UTR中存在miR-335-5p調控的作用序列。6.miR-335-5p對腎癌細胞的抑制增殖作用部分通過AKT/FOXO1信號通路實現(xiàn)。結論：1.與癌旁對照組織相比,腎癌組織中miR-335-5p相對表達量顯著下調。但是本研究未能提示miR-335-5p表達量高低與腎癌的惡性程度相關。2.體外轉染miR-335-5p mimic使其過表達使得腎癌細胞株發(fā)生細胞周期阻滯及增殖抑制。同時,miR-335-5p的過表達還削弱了腎癌細胞的克隆形成能力。3.CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶點,還可以通過/AKT/FOXO1信號通路發(fā)揮抑制增殖作用。
【關鍵詞】：腎癌 微小RNA 增殖 G1期阻滯 CDK2 CCNE2
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 致謝6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 英文縮寫一覽表12-15
• 引言15-20
• 參考文獻17-20
• 1. miR-335-5P在人腎癌中的表達情況及調控機制20-47
• 1.1 前言20-22
• 1.2 材料與方法22-33
• 1.3 結果33-40
• 1.4 討論40-42
• 1.5 結論42-43
• 1.6 參考文獻43-47
• 2. miR-335-5P對腎癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響47-70
• 2.1 前言47-49
• 2.2 材料和方法49-56
• 2.3 結果56-64
• 2.4 討論64-66
• 2.5 結論66-67
• 2.6 參考文獻67-70
• 3. miR-335-5P的靶基因及影響腎癌的分子機制探討70-100
• 3.1 前言70-72
• 3.2 材料與方法72-86
• 3.3 結果86-93
• 3.4 討論93-96
• 3.5 結論96-97
• 3.6 參考文獻97-100
• 小結與展望100-101
• 綜述101-111
• 參考文獻107-111
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果111-112
• 已發(fā)表文章112-122

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：miR-335-5p在腎癌中的抑癌作用及其分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257995