本文關(guān)鍵詞：線(xiàn)粒體途徑參與蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：本課題基于中醫(yī)學(xué)“以毒攻毒”理論,旨在研究蟾皮有效單體蟾毒靈在體外條件下對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并探討線(xiàn)粒體膜電位及線(xiàn)粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白在其中的作用,以初步探討蟾毒靈抗肺癌的有效分子機(jī)制。在抗癌新藥飛速發(fā)展的今天,為新型天然來(lái)源的抗腫瘤中藥的進(jìn)一步研發(fā)和以毒攻毒治法的臨床運(yùn)用提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：1.采用CCK-8法檢測(cè)蟾毒靈對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞體外增殖的抑制效應(yīng),篩選出有效作用劑量范圍,并判定量效關(guān)系。2. Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)低、中、高濃度組蟾毒靈作用48h下對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞儀分析4ng/mL蟾毒靈作用下對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期的影響。3.倒置顯微鏡觀察各濃度組蟾毒靈作用于肺癌A549細(xì)胞48h后對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響；并以透射電鏡觀察4ng/mL蟾毒靈作用后A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變及凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生。4.運(yùn)用JC-1染色探針在熒光顯微鏡下觀察4ng/mL蟾毒靈作用下A549細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的變化情況。5. Western Blot法檢測(cè)低、中、高濃度組蟾毒靈作用下肺癌A549細(xì)胞中與線(xiàn)粒體途徑凋亡相關(guān)的細(xì)胞色素C、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況；以及加入Caspase抑制劑后各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化,以探討線(xiàn)粒體途徑參與蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。研究結(jié)果：1.不同濃度的蟾毒靈均對(duì)肺癌A549細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制作用,與對(duì)照組比較,具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),且給藥濃度與抑制效用之間存在良好的依賴(lài)性,量效曲線(xiàn)明顯。且4ng/mL濃度的蟾毒靈組與順鉑(4pμg/mL)組比較,其OD值未見(jiàn)明顯差異(P0.05),表明體外環(huán)境下中藥單體蟾毒靈的抗癌活性強(qiáng),量效性?xún)?yōu)勢(shì)明顯；同時(shí)擬定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蟾毒靈的最佳作用濃度為4ng/mL2.人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的蟾毒靈處理48h后,與正常組相比,各劑量組均導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞凋亡,差異明顯(P0.05),且總凋亡率及早期凋亡率均呈現(xiàn)出隨劑量增高而逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)；其中,各劑量組組間早期凋亡率相比較,除4ng/mL與8ng/mL比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P0.05),其余均差異明顯(P0.05),表明肺癌細(xì)胞凋亡程度與蟾毒靈劑量呈一定比例正相關(guān)性,其量效關(guān)系良好。同時(shí),當(dāng)蟾毒靈以4ng/mL濃度作用于肺癌A549細(xì)胞48h后,細(xì)胞增殖周期中各期所占比例均有不同程度的變化；其中,與正常組比較,僅見(jiàn)兩者的S期比例存在顯著性差異(P0.01),表明經(jīng)蟾毒靈作用后S期比例下降明顯,而G1、G2/M期未見(jiàn)明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示S期阻滯可能是蟾毒靈抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一3.倒置顯微鏡觀察正常對(duì)照組A549細(xì)胞呈飽滿(mǎn)梭性貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞輪廓清晰、排列緊密,生長(zhǎng)狀況良好；而各濃度蟾毒靈組均可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目不同程度的減少,隨著給藥濃度的增加,A549細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮變圓并脫壁、細(xì)胞密度逐漸減少、細(xì)胞間隙逐漸增大、胞漿顆粒逐漸增多,甚至可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片。上述現(xiàn)象表明經(jīng)蟾毒靈處理后,肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯的抑制。4ng/mL蟾毒靈作用于人肺癌A549細(xì)胞48h后透射電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體積明顯皺縮,細(xì)胞表面絨毛較少,核仁消失,染色質(zhì)固縮凝集,并沿核膜形成數(shù)個(gè)團(tuán)塊狀邊集；細(xì)胞器如線(xiàn)粒體數(shù)量減少、線(xiàn)粒體膜腫脹、線(xiàn)粒體嵴破壞；尚未形成明顯的凋亡小體。而正常對(duì)照組細(xì)胞膜表面光滑完整,可見(jiàn)微絨毛,胞質(zhì)密度均勻,無(wú)空泡,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,核仁完整,居中或邊移；細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)較清晰、完整。4.熒光顯微鏡觀察染色后細(xì)胞,并分別拍攝紅色和綠色通道,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均采用相同曝光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的綠色熒光強(qiáng)度相當(dāng),而紅色熒光較對(duì)照組相對(duì)偏弱。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組紅/綠熒光強(qiáng)度比值下降明顯(P0.05),提示線(xiàn)粒體膜電位去極化程度增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明線(xiàn)粒體膜電位在蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要的作用。5.經(jīng)蟾毒靈作用48h后,與對(duì)照組相比,肺癌A549細(xì)胞中胞漿Cyt C蛋白表達(dá)量隨給藥濃度增加而逐漸上調(diào),而Cyt C蛋白總表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化,由此表明蟾毒靈的促凋亡作用可能與細(xì)胞色素C向胞漿內(nèi)釋放的過(guò)程密切相關(guān)。隨著給藥濃度的增加,蟾毒靈各組的活化Caspase-3蛋白表達(dá)量亦逐漸增強(qiáng),而蟾毒靈聯(lián)合Caspase抑制劑的對(duì)照組并未引出活化Caspase-3蛋白。因此,可以說(shuō)明在蟾毒靈的促凋亡機(jī)制中,Caspase-3活化是其必不可少的步驟。上述實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步證實(shí),通過(guò)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜內(nèi)的細(xì)胞色素C向胞漿內(nèi)釋放,從而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終活化Caspase-3,即線(xiàn)粒體凋亡途徑,是蟾毒靈發(fā)揮凋亡作用的有效機(jī)制之一。研究結(jié)論：1.蟾毒靈在體外環(huán)境可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng),呈明顯的劑量依賴(lài)性；其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及干擾周期有關(guān)；2.蟾毒靈可通過(guò)誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞早期凋亡抑制細(xì)胞增殖,細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡早期形態(tài)學(xué)改變,該效應(yīng)與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)性；同時(shí),干擾肺癌A549細(xì)胞S期合成可能是其作用機(jī)制之一；3.蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程呈線(xiàn)粒體依賴(lài)性,通過(guò)降低線(xiàn)粒體膜電位、影響線(xiàn)粒體功能從而促發(fā)早期凋亡；4.線(xiàn)粒體途徑的激活是蟾毒靈發(fā)揮促凋亡作用的方式之一,分子層面可見(jiàn)該途徑相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素C在蟾毒靈作用下向胞漿釋放,并順次啟動(dòng)Caspase家族激活,并由Caspase-3最終執(zhí)行凋亡。
【關(guān)鍵詞】：蟾毒靈 以毒攻毒 肺癌 線(xiàn)粒體途徑 細(xì)胞色素C Caspase-3
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R273
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 理論研究16-34
• 一、肺癌的中西醫(yī)研究現(xiàn)狀16-26
• (一) 中醫(yī)從“毒”論治肺癌16-23
• 1. 歷史溯源16
• 2. 從“毒”識(shí)癌16-19
• 3. 以“毒”治癌19-21
• 4. 章永紅教授臨證以毒攻毒治癌經(jīng)驗(yàn)21-23
• (二) 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肺癌研究概況23-26
• 1. 組織分型與常規(guī)治療23-24
• 2. 分子分型與靶向治療24-26
• 二、線(xiàn)粒體途徑參與細(xì)胞凋亡的研究26-30
• 1. 凋亡狀態(tài)下線(xiàn)粒體的變化26-29
• 2. 作用于線(xiàn)粒體途徑的抗腫瘤中藥研究29-30
• 三、蟾毒靈抗腫瘤作用的機(jī)制研究30-34
• 1. 抑制腫瘤增殖30
• 2. 調(diào)控細(xì)胞周期30
• 3. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化30-31
• 4. 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡31-33
• 5. 拮抗腫瘤血管生成33
• 6. 逆轉(zhuǎn)多藥耐藥33-34
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究34-66
• 實(shí)驗(yàn)一 CCK-8法檢測(cè)蟾毒靈體外抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的作用35-41
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料35-36
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-39
• 4. 討論39-41
• 實(shí)驗(yàn)二 流式細(xì)胞儀檢測(cè)蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)其增殖周期的影響41-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 4. 討論46-48
• 實(shí)驗(yàn)三 蟾毒靈對(duì)肺癌A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)及線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的影響48-54
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-52
• 4. 討論52-54
• 實(shí)驗(yàn)四 蟾毒靈對(duì)肺癌A549細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響54-59
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-57
• 4. 討論57-59
• 實(shí)驗(yàn)五 Western Blot檢測(cè)蟾毒靈對(duì)肺癌A549細(xì)胞Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響59-66
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料59-60
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法60-63
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-64
• 4. 討論64-66
• 第三部分 結(jié)語(yǔ)66-68
• 一、結(jié)論66
• 二、創(chuàng)新點(diǎn)66
• 三、不足及展望66-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 附錄75-82
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果82-83
• 致謝83-84
• 作者簡(jiǎn)介84

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：線(xiàn)粒體途徑參與蟾毒靈誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：257809