【摘要】：研究背景和目的胃癌(Gastric carcinoma,GC)是一種常見的消化道惡性腫瘤,具有高發(fā)病率、高死亡率的特點。在全世界范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的排名中居于第5位,而致死率則位居第3位。在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中位居第2位,死亡率位列第3位,因此研究引起胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的具體機制,進而探索新的干預措施,提高胃癌的治療效果,達到延長患者的存活率,改善患者的生活質(zhì)量的目的等方面均具有重大的意義。腫瘤介導的免疫抑制已被認為是腫瘤逃避免疫破壞的關鍵因素之一,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。T-reg細胞作為腫瘤免疫逃逸機制的一種重要媒介,CD4+CD25+Fox3+Treg細胞則是T-reg細胞中的一種特殊的亞群,具有免疫抑制和免疫無能兩大特性,并在多種惡性腫瘤的組織和外周血中呈現(xiàn)出高表達,可能在腫瘤的特異性位點抑制腫瘤的T細胞反應。在對腫瘤的免疫抑制機制進行研究的同時,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,也在針對性的研究了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的蛋白編碼基因功能。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已被證實參與胃腸道腫瘤的形成與發(fā)展,并可能以多種方式參與基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,可作為早期消化道腫瘤的篩查標志。既往對胃癌的lncRNA的研究中,主要是對胃癌組織及癌旁組織的lncRNA進行檢測,并且對胃癌發(fā)病機制的研究主要集中在腫瘤細胞的lncRNA的表達異常上,而很少涉及腫瘤免疫細胞的作用機制。本研究擬通過與健康對照組相對比,檢測胃癌患者外周血中T細胞是否存在異常分布。并通過高通量芯片篩查技術(shù)探索相應T細胞中是否存在lncRNA異常表達,經(jīng)篩查出具有高表達及高穩(wěn)定性的linc-POU3F3作為代表,探索linc-POU3F3與T-reg細胞之間的相關作用。此外,前人研究已發(fā)現(xiàn)T-reg細胞通過TGF-beta信號通路發(fā)揮作用,并且有研究認為linc-POU3F3也可直接激活TGF-beta信號通路而在腫瘤的增殖中起作用,但具體機制尚不明確。因此,在本研究最后部分擬通過免疫共沉淀技術(shù)來揭示linc-POU3F3的調(diào)控作用,并探索其與T-reg細胞的相互作用機制。研究方法在本研究中,首先采集胃癌患者(n=40)及健康對照組(n=40)的外周血,通過細胞分離培養(yǎng)技術(shù)提取外周血中的T淋巴細胞,并采用流式細胞技術(shù)檢測外周血中T-reg細胞的表達。同時,運用高通量長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄基因芯片技術(shù)對胃癌患者的血漿樣本進行篩選,選擇表達最高也最穩(wěn)定的lncRNA作為候選的研究目標,并將其與胃癌患者的相關臨床信息進行結(jié)合分析。經(jīng)RT-PCR對其進行檢測,從而了解該lncRNA在胃癌外周血中T-reg細胞中表達。在第二部分研究中,主要針對linc-POU3F3在免疫細胞及腫瘤細胞中的功能進行研究。為了進一步探索linc-POU3F3對T細胞的作用,尤其是對T-reg細胞分布的影響。采用慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染的方法將linc-POU3F3與T細胞相結(jié)合從而獲得穩(wěn)定的細胞株,并通過免疫熒光及RT-PCR檢測linc-POU3F3的表達狀態(tài),并采用流式細胞學檢測經(jīng)慢病毒包裝的T-reg細胞的表達水平。應用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)將過表達linc-POU3F3的T細胞與腫瘤細胞進行共同培養(yǎng)增殖,從而觀察腫瘤細胞的增殖狀態(tài)。最后部分,針對linc-POU3F3的調(diào)控機制進行了研究。據(jù)研究,linc-POU3F3可以直接激活TGF-beta信號通路,并且T-reg細胞的分布與TGF-beta信號通路是密切相關的。在此研究階段,我們采用放射免疫沉淀技術(shù)及western blot方法來檢測linc-POU3F3與TGF-beta之間的作用。研究結(jié)果經(jīng)流式細胞學檢測在胃癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T-reg細胞的分布水平明顯高于健康對照組,而且通過lncRNA微列檢測表明在胃癌患者T-reg細胞的lncRNAs與對照組相比表達異常。通過對已知的腫瘤相關的lncRNA進行篩查,發(fā)現(xiàn)linc-POU3F3表現(xiàn)出最高的倍數(shù)變化以及最穩(wěn)定的表達形態(tài),因此我們將linc-POU3F3作為潛在的標志物進行研究。結(jié)合胃癌患者的有關臨床資料進行分析,發(fā)現(xiàn)linc-POU3F3可能對患者胃癌的生長分布及臨床TNM分期等方面均有一定的影響作用。在體外細胞功能的研究發(fā)現(xiàn),通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染的T細胞中l(wèi)inc-POU3F3呈現(xiàn)出過表達狀態(tài),linc-POU3F3的過表達促進了細胞的增殖及侵襲能力,并伴有體外T-reg細胞的分布增加。進一步將T-reg細胞與腫瘤細胞進行共培養(yǎng),結(jié)果表明linc-POU3F3上調(diào)培養(yǎng)的T細胞明顯促進了腫瘤細胞的增殖。在對linc-POU3F3調(diào)控機制的研究則顯示與TGF-beta信號通路的激活相關。通過體外實驗表明,linc-POU3F3可以直接與TGF-beta相結(jié)合,引起TGF-beta的上調(diào),并通過Smad2/3磷酸化激活TGF-beta信號通路,從而在增加胃癌細胞的增殖中發(fā)揮重要的作用,進而進一步的影響著胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)論linc-POU3F3過表達可導致胃癌患者外周血中T-reg細胞的分布增加,并且linc-POU3F3過表達的T-reg細胞可促進胃癌細胞增殖能力并通過招募TGF-beta從而激活TGF-beta信號通路來促進腫瘤細胞的增殖。本研究可能為胃癌免疫細胞中l(wèi)ncRNA的功能的探索提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 宋杰;陳鳳格;趙偉;趙冬;;胃癌的發(fā)病率現(xiàn)狀與治療研究進展[J];中國慢性病預防與控制;2016年09期

2 凌博凡;侯茜;陳玉超;鄒璽;王瑞平;;調(diào)節(jié)性T細胞在胃癌中的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2015年03期

3 季加孚;;我國胃癌防治研究三十年回顧[J];中國腫瘤臨床;2013年22期

4 Wei-Jun Cao;Hai-Lu Wu;Bang-Shun He;Yu-Shu Zhang;Zhen-Yu Zhang;;Analysis of long non-coding RNA expression profiles in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2013年23期

5 向劍鋒;殷慶飛;陳玲玲;;探索長非編碼RNA在哺乳動物細胞中的功能秘密[J];中國細胞生物學學報;2013年03期

6 宋皓軍;俞秀沖;夏天;郭俊明;肖丙秀;;長鏈非編碼RNA與腫瘤的關系及其臨床價值[J];中國細胞生物學學報;2012年07期

，

本文編號：2363297