本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 低氧 微小RNA 巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 自噬和血管擬態(tài)　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Mutiforme,GBM)是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)并且惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤,在全部類型的腦膠質(zhì)瘤中能夠占到50%以上。根據(jù)組織病理學(xué)特征,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)將腦膠質(zhì)瘤按照惡性程度由低到高分為Ⅰ-Ⅳ四個(gè)等級(jí),其中GBM被認(rèn)定為星形細(xì)胞瘤病理類型中惡性程度最高的Ⅳ級(jí)。近年來(lái),雖然針對(duì)GBM的傳統(tǒng)手術(shù)切除聯(lián)合放化療、新型的抗血管生成治療以及靶向免疫治療等策略不斷豐富和改進(jìn),但是在臨床實(shí)踐中仍未能取得令人滿意的效果,GBM治愈率低,復(fù)發(fā)率高,患者預(yù)后極差。為了完善和補(bǔ)充當(dāng)前的GBM治療策略,改善患者的生存預(yù)后,進(jìn)一步探索和揭示GBM惡性生物學(xué)進(jìn)展的分子調(diào)控機(jī)制仍然十分迫切。低氧(Hypoxia)是實(shí)體性腫瘤微環(huán)境中最為普遍存在的標(biāo)志性特征。由于氧氣輸送和氧氣消耗之間的不平衡,約一半以上的實(shí)體腫瘤中存在廣泛的低氧區(qū)域。低氧微環(huán)境和低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factor,HIF)所依賴的下游分子通路在腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)展中起到關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用,其參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移,上皮表型向間充質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),內(nèi)皮血管新生,以及免疫逃逸。此外,臨床研究數(shù)據(jù)表明低氧與多種腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、放化療耐受性以及患者的不良預(yù)后有著緊密的聯(lián)系。GBM作為惡性程度極高的實(shí)體腫瘤,存在廣泛的低氧區(qū)域,然而其低氧下的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。因此對(duì)這一機(jī)制的深入探索,有利于尋找新的治療靶點(diǎn),進(jìn)而采取適當(dāng)?shù)氖侄谓档湍z質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展,改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。細(xì)胞自噬(Autophagy)是一種利用自噬溶酶體回收、清除細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的自我消化分解代謝過(guò)程。這種自我清除代謝廢物、重新回收能量的生理性代謝過(guò)程在細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)、自我修復(fù)、逃避惡劣環(huán)境等方面起到重要的作用。腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)為其自身提供了有效的額外供養(yǎng)途徑,提高了清除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的能力,有利于腫瘤細(xì)胞在低氧、低養(yǎng)、饑餓等惡劣微環(huán)境中的生存以及惡性生物學(xué)進(jìn)展。越來(lái)越多的研究表明,低氧能夠誘導(dǎo)GBM細(xì)胞自噬活性的增強(qiáng),并且在一定程度上提高了其對(duì)化療藥物的耐受性。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)約19-22核苷酸的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA,通過(guò)作用于靶基因的3'非翻譯區(qū)(3' untranslated region,3' UTR)導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控。MiRNA在細(xì)胞生理學(xué)活動(dòng)過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用極其廣泛,其中包括增殖、分化、凋亡以及自噬等。在GBM中,低氧微環(huán)境誘導(dǎo)大量miRNAs產(chǎn)生了差異性的表達(dá),給miRNA表達(dá)譜留下了特定的低氧印跡。這些差異表達(dá)的miRNAs可能在低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞自噬水平的增高、侵襲遷移能力的增強(qiáng)以及耐藥性的產(chǎn)生中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。然而,低氧在GBM自噬活性以及惡性進(jìn)展中作用的關(guān)鍵調(diào)控miRNAs仍然不十分明確,需要進(jìn)一步深入研究。血管擬態(tài)(Vasculogenic Mimicry,VM)是完全不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞,由惡性腫瘤細(xì)胞自身形成的管道樣脈絡(luò)結(jié)構(gòu),具有供血功能。從血管擬態(tài)這種現(xiàn)象被定義以來(lái),它在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn),其中包括GBM。血管擬態(tài)的形成增加了 GBM血流量,能夠?yàn)榈脱跸律L(zhǎng)迅速的膠質(zhì)瘤細(xì)胞提供額外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應(yīng)。之前的研究表明,形成VM的腫瘤細(xì)胞具有產(chǎn)生可塑性表型的特性,這種表型的可塑性改變能夠受到低氧的調(diào)節(jié)。值得我們注意的是,低氧能夠通過(guò)誘導(dǎo)GBM細(xì)胞發(fā)生EMT促進(jìn)血管擬態(tài)的形成。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF)是具有促進(jìn)炎癥發(fā)生和促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展雙重功能的細(xì)胞因子。MIF在多種類型的惡性腫瘤中高度表達(dá),其中包括GBM。近年來(lái),對(duì)膠質(zhì)瘤的深入的研究發(fā)現(xiàn)MIF表達(dá)水平與其臨床病理分級(jí)以及浸潤(rùn)擴(kuò)散程度具有密切的正相關(guān)關(guān)系。更重要的是,低氧能夠進(jìn)一步增加GBM中MIF的表達(dá)和分泌,而且MIF與GBM細(xì)胞的自噬、侵襲遷移、血管生成和免疫逃避有著密切聯(lián)系。然而,低氧下MIF對(duì)GBM的作用和具體調(diào)控分子機(jī)制尚不清楚,仍有待進(jìn)一步深入研究。本課題主要從低氧促進(jìn)GBM細(xì)胞自噬以及血管擬態(tài)生成兩方面進(jìn)行研究,分別深入探討了相關(guān)的miR224-3p和MIF對(duì)GBM的作用以及其具體作用機(jī)制。首先,從低氧下GBM細(xì)胞miRNA表達(dá)譜基因芯片入手,我們通過(guò)全面分析篩選發(fā)現(xiàn)芯片中顯著下調(diào)的miR224-3p參與介導(dǎo)了低氧誘導(dǎo)的GBM自噬水平增強(qiáng)。隨后,進(jìn)一步深入研究了其對(duì)GBM的自噬作用及其具體機(jī)制。除此以外,我們發(fā)現(xiàn)MIF對(duì)低氧下GBM細(xì)胞血管擬態(tài)的形成有著關(guān)鍵的調(diào)控作用,并且進(jìn)一步探索了其具體的分子機(jī)制。本課題對(duì)低氧下GBM惡性生物學(xué)進(jìn)展的基礎(chǔ)研究,為GBM患者提供了新的治療靶點(diǎn),有著重要學(xué)術(shù)意義和廣闊的臨床應(yīng)用前景。第一部分MiR224-3p對(duì)低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平的影響及其作用機(jī)制的研究1.目的(1)基于miRNA表達(dá)譜基因芯片,通過(guò)分析常氧、低氧下GBM細(xì)胞miRNAs的差異表達(dá),篩選出低氧下調(diào)的miRNAs中與自噬相關(guān)的miRNAs(miR224-3p)。(2)明確miR224-3p對(duì)低氧下GBM細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用,闡明miR224-3p調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞自噬的具體作用機(jī)制和直接作用靶基因。(3)揭示膠質(zhì)瘤組織中mmiR224-3p的表達(dá)水平,以及miR224-3p與靶基因表達(dá)量之間的相關(guān)性。(4)探究miR224-3p對(duì)GBM細(xì)胞增殖和低氧誘導(dǎo)凋亡的作用。(5)明確miR224-3p對(duì)GBM細(xì)胞體內(nèi)成瘤生長(zhǎng)的影響。2.方法(1)細(xì)胞低氧處理及m i RNA芯片的檢測(cè)通過(guò)低氧培養(yǎng)箱實(shí)現(xiàn)物理性低氧,培養(yǎng)條件設(shè)定為:37℃,5%CO2,1%O2。分別提取低氧處理組(24h)和對(duì)照組U251細(xì)胞的總miRNAs,進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的檢測(cè),經(jīng)過(guò)分析獲取全面的miRNA表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)。(2)mRNA,miRNA和蛋白水平的檢測(cè)收集不同WHO級(jí)別臨床膠質(zhì)瘤組織后,提取總mRNA和制備石蠟切片,應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)各相關(guān)miRNAs、mRNAs和蛋白分子的表達(dá)水平。對(duì)U251和U87兩種GBM細(xì)胞系進(jìn)行特定的處理并分別提取總RNA和總蛋白,使用q-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)U251和U87細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNAs,miRNAs和蛋白分子的表達(dá)水平。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及GFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建分別用 miR224-3p mimics,miR224-3p inhibitor,ATG5 質(zhì)粒,FIP200 質(zhì)粒,含有miR224-3p互補(bǔ)結(jié)合序列的ATG5 3' UTR突變型或野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,含有miR224-3p互補(bǔ)結(jié)合序列的FIP200 3' UTR突變型或野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)U251和U87細(xì)胞進(jìn)行Lipo2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用于過(guò)表達(dá)或敲除目的蛋白或miR224-3p,進(jìn)而研究各種相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平的變化。將含有GFP-LC3B編碼序列的質(zhì)粒用慢病毒進(jìn)行包裝,通過(guò)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染U251和U87細(xì)胞系,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3B綠色熒光蛋白細(xì)胞系后,對(duì)自噬水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。(4)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬水平檢測(cè)對(duì)自噬水平的檢測(cè)分為以下幾種方法:①透射電子顯微鏡直接觀察U251細(xì)胞中典型雙層膜結(jié)構(gòu)自噬小體的數(shù)量,此方法為監(jiān)測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。②Western blot技術(shù)檢測(cè)U251和U87細(xì)胞自噬主要標(biāo)志性蛋白LC3B和P62表達(dá)水平。③倒置熒光顯微鏡觀察GFP-LC3B穩(wěn)定表達(dá)U251和U87細(xì)胞中熒光自噬小體陽(yáng)性細(xì)胞,并統(tǒng)計(jì)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。④自噬小體和溶酶體融合抑制劑巴弗洛霉素A1(BafilomycinAl,BAF)藥物應(yīng)用于自噬流的檢測(cè)。(5)M i R224-3p下游調(diào)控靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)(如:targetscan、PicTar、miRanda等)篩選出miR224-3p最可能直接作用的自噬相關(guān)靶基因。之后通過(guò)q-PCR和Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。最后,分別對(duì)U251和U87細(xì)胞進(jìn)行miR224-3p mimics和含有靶基因突變型或野生型結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后,進(jìn)行雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)確定miR224-3p直接作用的靶基因。(6)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)分別對(duì) U251 和 U87 細(xì)胞進(jìn)行 miR224-3p mimics 和 miR224-3p inhibitor 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,然后用CCK-8和EdU試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)GBM細(xì)胞活力和增殖能力。用Annexin V-FITC雙染流式試劑盒和抗裂解的caspase3免疫細(xì)胞化學(xué)方檢測(cè)低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR224-3p mimics的U251和U87細(xì)胞凋亡水平。(7)裸鼠皮下人腦GBM細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)用U87細(xì)胞系建立裸鼠皮下異位成瘤模型。U87細(xì)胞在皮下成瘤后,行瘤內(nèi)注射lenti-miRNA224-3p mimics和lenti-NCm慢病毒,同時(shí)間隔1天測(cè)量miR224-3p mimics組和NCm組腫瘤體積以及終末腫瘤重量。3.結(jié)果(1)低氧誘導(dǎo)GBM明細(xì)胞自噬水平的增強(qiáng)Western blot和GFP-LC3B穩(wěn)定細(xì)胞系熒光自噬小體檢測(cè)分別顯示,與常氧組相比,GBM細(xì)胞U251和U87在低氧下自噬水平增強(qiáng)(LC3BⅡ升高,P62降低,自噬小體陽(yáng)性細(xì)胞比例升高),且呈處理時(shí)間梯度依賴效應(yīng)。BAF自噬流阻斷實(shí)驗(yàn)顯示低氧誘導(dǎo)U251和U87細(xì)胞自噬流被明顯阻斷(LC3BⅡ和P62表達(dá)均明顯升高),進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)論。(2)在GBM細(xì)胞中,低氧誘導(dǎo)miR224-3p表達(dá)下調(diào);在人腦膠質(zhì)瘤組織中,miR224-3p呈低水平表達(dá)U251細(xì)胞miRNA表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示,miR224-3p為篩選出的低氧下調(diào)最顯著的mmmiRNA。Q-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證,低氧下U251和U87細(xì)胞中miR224-3p表達(dá)水平明顯下降。30例臨床膠質(zhì)瘤組織(14例低級(jí)別膠質(zhì)瘤,WHOⅠ,Ⅱ級(jí)和16例高級(jí)別膠質(zhì)瘤,WHO Ⅱ,Ⅳ級(jí))和6例正常腦組織q-PCR結(jié)果顯示,與正常腦組織相比,miR224-3p在膠質(zhì)瘤組織中明顯低表達(dá)。(3M i R224-3p參與調(diào)控低氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平的增強(qiáng)透射電子顯微鏡、Western blot和GFP-LC3B細(xì)胞系熒光自噬小體檢測(cè)分別發(fā)現(xiàn),常氧下,敲除內(nèi)源性miR224-3p的U251和U87細(xì)胞自噬及自噬流水平明顯增強(qiáng);低氧下,過(guò)表達(dá)miR224-3p能夠阻斷U251和U87細(xì)胞自噬水平的升高。(4)MiR224-3p通過(guò)直接作用于下游靶基因ATG5和FIP200調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬水平Q-PCR和Western blot檢測(cè)顯示,在眾多miR224-3p預(yù)測(cè)的自噬相關(guān)靶基因中,過(guò)表達(dá)和敲除miR224-3p分別同時(shí)明顯降低和升高FIP200和ATG5表達(dá)。而且,共同過(guò)表達(dá)FIP200和ATG5能夠逆轉(zhuǎn)miR224-3p過(guò)表達(dá)對(duì)低氧誘導(dǎo)自噬的阻斷作用。更進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR224-3p能夠分別與FIP200和ATG5的3' UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合發(fā)揮直接靶向抑制作用。(5)在人腦膠質(zhì)瘤組織中,m i R224-3p含量與FIP200和ATG5的表達(dá)水平具有負(fù)性相關(guān)關(guān)系免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤組織中低氧標(biāo)志物HIF1 α和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B較正常腦組織明顯高表達(dá)。同時(shí)經(jīng)過(guò)定量和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),30例不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織FIP200和ATG5的表達(dá)水平分別和miR224-3p的含量呈現(xiàn)出有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的負(fù)相關(guān)關(guān)系。(6)MiR224-3p減弱膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力,并且能夠增加低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞的凋亡。CCK-8法和EdU法檢測(cè)分別顯示,過(guò)表達(dá)miR224-3p的U251和U87細(xì)胞活力和增殖能力明顯增強(qiáng),反之亦然。Annexin V-FITC雙染流式試劑盒和抗裂解的caspase3免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR224-3p能夠顯著提高低氧誘導(dǎo)的U251和U87細(xì)胞凋亡水平。(7)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,m i R224-3p抑制GBM的生長(zhǎng)利用U87細(xì)胞系建立裸鼠皮下人腦膠質(zhì)瘤異位成瘤模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR224-3p mimics慢病毒組腫瘤平均體積和平均終末重量均顯著低于對(duì)照慢病毒組。4.結(jié)論(1)通過(guò)miRNA表達(dá)譜分析,首次篩選出并且證實(shí)了 miR224-3p在低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞自噬增強(qiáng)中起到關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。(2)低氧能夠明顯降低GBM細(xì)胞miR224-3p的表達(dá)水平。(3)MiR224-3p通過(guò)抑制自噬相關(guān)基因FIP200和ATG5的表達(dá)來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞的自噬水平。(4)MiR224-3p通過(guò)結(jié)合FIP200和ATG5 mRNA的3' UTR直接抑制靶基因的表達(dá)水平。(5)在膠質(zhì)瘤組織中,miR224-3p較正常腦組織表達(dá)水平低;并且miR224-3p分別與FIP200和ATG5的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)的關(guān)系。(6)MiR224-3p能夠減弱GBM細(xì)胞的增殖能力以及增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡敏感性。(7)MiR224-3p能夠抑制GBM細(xì)胞體內(nèi)的生長(zhǎng)。第二部分MIF在低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤EMT和血管擬態(tài)生成中的作用以及其具體機(jī)制的研究1.目的(1)在膠質(zhì)瘤臨床組織中,研究低氧指標(biāo)HIF1α分別與MIF和MIF受體CXCR4表達(dá)量之間的相關(guān)性。(2)在膠質(zhì)瘤臨床組織中,揭示HIF1α,MIF,CXCR4和VM四者之間的相關(guān)性;并且對(duì)MIF、CXCR4的表達(dá)水平以及VM陽(yáng)性對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(3)明確低氧對(duì)GBM細(xì)胞EMT以及VM生成的影響。(4)闡明MIF在低氧誘導(dǎo)GBM細(xì)胞EMT和VM形成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。(5)通過(guò)特異性藥物阻斷MIF的下游CXCR4相關(guān)信號(hào)通路,探究MIF在低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞EMT和VM生成中的具體作用機(jī)制。(6)應(yīng)用裸鼠皮下GBM細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn),在體內(nèi)水平驗(yàn)證MIF在EMT中的作用及其下游的具體通路機(jī)制。2.方法(1)細(xì)胞低氧處理及mRNA和蛋白水平的檢測(cè)常氧和低氧下,對(duì)U251和U87兩種GBM細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的rhMIF、AMD3100、LY294002,ISO-1處理刺激后,分別提取總RNA和總蛋白。然后使用q-PCR和Western blot方法檢測(cè)U251和U87細(xì)胞內(nèi)需要檢測(cè)的相關(guān)EMT標(biāo)志物mRNAs和蛋白分子的表達(dá)水平。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000對(duì)siMIF進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用于敲除U251和U87細(xì)胞內(nèi)源性MIF的表達(dá),進(jìn)而檢測(cè)各種相關(guān)EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的變化。(3)臨床組織標(biāo)本免疫組化和免疫熒光收集臨床不同WHO級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織[25例臨床膠質(zhì)瘤組織(12例低級(jí)別膠質(zhì)瘤,WHO Ⅰ,Ⅱ級(jí)和13例高級(jí)別膠質(zhì)瘤,WHO Ⅲ,Ⅳ級(jí))和6例正常腦組織],制備石蠟切片。然后應(yīng)用免疫組化檢測(cè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中HIF1 α、MIF、CXCR4的表達(dá)水平及血管擬態(tài)的生成[CD34與PAS(過(guò)碘酸希夫反應(yīng))共染陽(yáng)性]情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)連續(xù)石蠟切片中HIF1 α、MIF、CXCR4以及血管擬態(tài)的共定位現(xiàn)象。(4)細(xì)胞免疫熒光對(duì)U251和U87細(xì)胞分別進(jìn)行低氧以及相應(yīng)的rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1處理刺激。然后用4%多聚甲醛固定,通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞中MIF、CXCR4、上皮表型標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)水平。(5)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管擬態(tài)形成實(shí)驗(yàn)利用基質(zhì)膠3D環(huán)境,對(duì)低氧以及rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1分別處理后的U87細(xì)胞進(jìn)行血管擬態(tài)形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)不同處理因素對(duì)U87細(xì)胞形成血管擬態(tài)能力的影響。(6)裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)用GBM細(xì)胞系U87建立人腦膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠皮下異位模型。U87細(xì)胞在皮下成瘤后,隨機(jī)分為五組,分別行瘤周注射PBS,rhMIF,rhMIF和AMD3100,rhMIF和LY294002,ISO-1。三周后進(jìn)行終末腫瘤體積的測(cè)量,并且對(duì)腫瘤進(jìn)行石蠟包埋切片,進(jìn)行免疫組化染色,檢測(cè)組間N-cadherin(間充質(zhì)表型標(biāo)志物)和E-cadherin(上皮表型標(biāo)志物)的表達(dá)水平。3.結(jié)果(1)在臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,MIF和CXCR4的表達(dá)水平與HIF1 α含量呈正相關(guān)關(guān)系免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,MIF、CXCR4和HIF1α的表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤中明顯高于正常腦組織,并且高級(jí)別膠質(zhì)瘤高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤。同時(shí),定量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明,HIF1α分別與MIF和CXCR4的表達(dá)水平呈線性正性相關(guān)關(guān)系。連續(xù)石蠟切片免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),MIF和CXCR4的表達(dá)與HIF1 α在膠質(zhì)瘤組織中存在共定位現(xiàn)象。(2)在膠質(zhì)瘤組織中,血管擬態(tài)的形成與MIF和CXCR4的共同高表達(dá)密切相關(guān)PAS染色和CD34免疫組化共染結(jié)果顯示,VM形成標(biāo)本陽(yáng)性率在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯高于低級(jí)別,并且共同高表達(dá)MIF和CXCR4與VM的形成明顯正相關(guān)。連續(xù)石蠟切片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),MIF、CXCR4、HIF1α和VM在膠質(zhì)瘤組織中存在共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步的生存分析結(jié)果顯示,VM陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤患者生存期明顯低于VM陰性患者。(3)MIF和CXGR4的表達(dá)水平在低氧下升高,并且低氧和MIF誘導(dǎo)EMT和VII的形成Western blot、q-PCR和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),MIF和CXCR4的表達(dá)在低氧下明顯升高,以及低氧和MIF促進(jìn)EMT(上皮樣表型標(biāo)志物E-cadherin的下降和間充質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin的升高)。VM形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低氧和MIF能夠促進(jìn)GBM細(xì)胞VM形成。(4)低氧通過(guò)MIF-CXCR4-AKT-EMT通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞的VM形成Q-PCR、Western blot檢測(cè)和VM形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MIF誘導(dǎo)的EMT和VM形成能夠被CXCR4和AKT抑制劑阻斷。而且,低氧誘導(dǎo)的EMT和VM形成能夠被MIF、CXCR4和AKT抑制劑阻斷。(5)在體內(nèi),MIF促進(jìn)GBM的EMT和生長(zhǎng)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),MIF處理組皮下腫瘤體積明顯高于PBS組、MIF+AMD3100組和MIF+ LY294002組,并且ISO-1組腫瘤體積小于PBS組。裸鼠皮下腫瘤免疫組化結(jié)果顯示,MIF組腫瘤細(xì)胞有顯著的EMT表現(xiàn)(E-cadherin降低,N-cadherin升高),而其它組無(wú)明顯影響。4.結(jié)論(1)膠質(zhì)瘤組織中存在抗內(nèi)皮細(xì)胞血管新生治療的補(bǔ)償途徑VM。(2)在膠質(zhì)瘤組織中,HIF1α分別與MIF和CXCR4的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。(3)在膠質(zhì)瘤組織中,HIFIα、MIF、CXCR4和VM四者存在共定位的密切聯(lián)系。(4)低氧能夠分別增強(qiáng)GBM細(xì)胞MIF和CXCR4的表達(dá)水平,并且促進(jìn)GBM細(xì)胞EMT和VM的形成。(5)MIF在低氧誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞EMT和VM形成中起到關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。(6)低氧下MIF和CXCR4表達(dá)水平的共同升高激活了 GBM細(xì)胞CXCR4下游AKT通路,促進(jìn)了 EMT的發(fā)生,進(jìn)而增強(qiáng)了 VM形成的能力。(7)MIF通過(guò)CXCR4-AKT-EMT通路促進(jìn)了 GBM細(xì)胞體內(nèi)的惡性生物學(xué)進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41
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本文編號(hào)：1530309