本文關(guān)鍵詞： PKM2 結(jié)直腸癌 CCL2 巨噬細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、前言結(jié)直腸癌是消化道中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。因此,深入研究結(jié)腸直腸癌分子機(jī)制及其關(guān)鍵信號(hào)通路分子的鑒定,對(duì)進(jìn)一步提高結(jié)腸直腸癌的治療水平具有重要意義。研究證實(shí)結(jié)腸直腸癌的發(fā)生進(jìn)展是一個(gè)眾多因素相互共同作用的過(guò)程。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境。而巨噬細(xì)胞具有促腫瘤血管新生和重塑腫瘤微環(huán)境等功能作用,但其如何募集到腫瘤部位及其發(fā)揮相關(guān)功能作用機(jī)理至今尚不完全清楚。丙酮酸激酶M2(PKM2)是糖酵解過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵限制酶,同時(shí)也是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄輔助因子,其PKM2在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的非糖酵解功能和作用日益得到人們的關(guān)注。在結(jié)直腸癌微環(huán)境中,PKM2是如何塑造腫瘤微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和存活,其機(jī)制尚不清楚。二、研究目的探討結(jié)直腸癌細(xì)胞中PKM2在結(jié)直腸癌微環(huán)境中對(duì)巨噬細(xì)胞募集的作用及其機(jī)制。三、研究方法本研究主要通過(guò)siRNA干擾等方法探討PKM2對(duì)巨噬細(xì)胞募集的相關(guān)趨化因子表達(dá)的影響;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法證實(shí)丙酮酸激酶對(duì)巨噬細(xì)胞募集相關(guān)趨化因子表達(dá)和活性影響的分子機(jī)制,進(jìn)而逆造腫瘤炎癥微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。研究結(jié)果1.臨床組織標(biāo)本免疫組化的結(jié)果顯示:相對(duì)于正常的對(duì)照組而言,在結(jié)直腸癌組織中丙酮酸激酶M2型表達(dá)量明顯增多,同時(shí)巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布也集中在腫瘤腺體周邊,同時(shí),蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果也表明丙酮酸激酶M2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)于正常腸上皮細(xì)胞的含量明顯增多2.條件培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,利用特異性siRNA敲低PKM2的表達(dá),明顯降低巨噬細(xì)胞的趨化和遷移。為了進(jìn)一步避免脫靶,我們利用已證實(shí)具有干擾效果的shPKM2慢病毒感染細(xì)胞并收集其條件培養(yǎng)基,隨后進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn),其結(jié)果與上述的一致。3.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:相對(duì)于對(duì)照組而言,干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞中PKM2的表達(dá)能夠明顯降低CCL2在mRNA水平上的表達(dá),同時(shí)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步表明,PKM2能夠影響CCL2的表達(dá)和分泌4.腸上皮細(xì)胞中內(nèi)源性的PKM2與IKKβ相互作用,然而,敲低PKM2的表能夠明顯抑制p65(Ser276)的磷酸化活性。5.p65的過(guò)表達(dá)可拯救敲低PKM2而引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞CCL2的轉(zhuǎn)錄活性的降低,且可恢復(fù)PKM2敲低引起的細(xì)胞侵襲能力的降低巨噬細(xì)胞趨化作用五、結(jié)論1.證實(shí)了結(jié)直腸癌組織中PKM2的表達(dá)量與巨噬細(xì)胞的數(shù)目和分布成正相關(guān)。2.PKM2調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞CCL2的表達(dá)和分泌促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化作用3.PKM2與p65相互作用,并調(diào)節(jié)p65 Ser276位點(diǎn)的磷酸化。4.敲掉結(jié)直腸癌細(xì)胞的PKM2的表達(dá)明顯抑制p65結(jié)合到CCL2的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)而降低其轉(zhuǎn)錄活性
[Abstract]:1. Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors in the digestive tract. Its morbidity and mortality are second only to gastric cancer, esophageal cancer and primary liver cancer. It is important to further improve the treatment level of colorectal cancer. It is confirmed that the progression of colorectal cancer is a process of interaction of many factors. The tumor microenvironment is the internal environment of tumor growth. Macrophages have the function of promoting tumor angiogenesis and remodeling tumor microenvironment. However, it is still unclear how it can recruit the tumor site and how it functions. Pyruvate kinase M2PKM2 is a key restriction enzyme in glycolysis, and it is also an important transcriptional cofactor. The non-glycolytic function and role of PKM2 in carcinogenesis and development have attracted more and more attention. In the microenvironment of colorectal cancer, PKM2 is responsible for shaping the tumor microenvironment and promoting the growth and survival of colorectal cancer. The mechanism is not clear. Second, the purpose of this study was to investigate the role of PKM2 in the microenvironment of colorectal cancer and its mechanism of macrophage recruitment. Methods siRNA interference was used to investigate the effect of PKM2 on the expression of chemokines in macrophage recruitment. The effects of pyruvate kinase on the expression and activity of chemokines associated with macrophage recruitment were confirmed by real-time fluorescence quantitative PCR, and then the inflammatory microenvironment of tumor was reversed. The immunohistochemical results of clinical tissues showed that the expression of pyruvate kinase M2 was significantly increased in colorectal cancer tissues compared with the normal control group. 2. At the same time, the number and distribution of macrophages are also concentrated around the tumor glands, at the same time, The results of Western blot also showed that the expression of pyruvate kinase M2 in colorectal cancer cells was significantly higher than that in normal intestinal epithelial cells 2. The chemotactic effect of conditioned medium on macrophages showed that the expression of pyruvate kinase M2 in colorectal cancer cells was significantly higher than that in control group. The expression of specific siRNA knockout PKM2 was used to significantly reduce the chemotaxis and migration of macrophages. In order to further avoid miss, we used shPKM2 lentivirus, which has been proved to have interference effect, to infect cells and collect its conditioned medium. The chemotaxis experiment was carried out, and the results were consistent with the results of .3. Real-time PCR experiment. The results showed that interfering the expression of PKM2 in colorectal cancer cells could significantly reduce the expression of CCL2 at the mRNA level compared with the control group. At the same time, the results of enzyme-linked immunosorbent assay further showed that PKM2 could affect the expression and secretion of CCL2. 4. Endogenous PKM2 interacts with IKK 尾 in intestinal epithelial cells. Knockout of PKM2 could significantly inhibit the phosphorylation activity of p65 ser276. 5. P65 could save the decrease of CCL2 transcription in colorectal cancer cells induced by knock down PKM2. And can restore the PKM2 knockdown induced cell invasion ability to reduce macrophage chemotaxis. It is confirmed that the expression of PKM2 is positively correlated with the number and distribution of macrophages. 2. PKM2 regulates the expression and secretion of CCL2 in colorectal cancer cells and promotes the chemotaxis of macrophages 3.PKM2 and p65 interact with each other. The phosphorylation of p65 Ser276 site was regulated. 4. The expression of PKM2 in knock out colorectal cancer cells significantly inhibited p65 binding to the promoter region of CCL2 and decreased its transcriptional activity.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：1495060