發(fā)布時間：2018-01-24 22:08

  本文關鍵詞： 肝細胞肝癌 NEK2 細胞增殖 凋亡及周期 腫瘤干細胞　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分NEK2在肝細胞肝癌組織中的表達及其與臨床預后的關系目的觀察NEK2在肝細胞肝癌(HCC)組織及癌旁肝組織中的表達情況,初步探討NEK2在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法1.Oncomine數據庫分析NEK2在HCC中的mRNA表達情況;2.免疫組化(IHC)檢測HCC中NEK2蛋白水平的表達及其與臨床病理參數之間的關系。結果Oncomine數據庫顯示NEK2 mRNA水平在HCC中的表達高于癌旁肝組織。IHC檢測40例HCC和癌旁肝組織,發(fā)現(xiàn)NEK2的表達主要定位于細胞質和細胞核上,40例肝癌患者標本中有23例呈高表達(57.5%),而癌旁中僅有3例呈高表達(7.5%),說明NEK2在蛋白表達水平上肝癌組織高于癌旁肝組織。收集分析136例HCC相關臨床病理資料,在腫瘤組織中NEK2的高表達與HCC患者的腫瘤大小(P=0.002)、TNM分期(P=0.028)及癌栓有無(P=0.039)呈正相關(均P0.05)。Kaplan-Meier法發(fā)現(xiàn)NEK2高表達患者總生存率(P0.01)與無瘤生存率(P0.05)比低表達者要差。Cox的單因素和多因素分析均顯示NEK2在肝癌組織中的高表達是影響患者預后的獨立因素。結論1.NEK2 mRNA和蛋白的表達水平在肝癌組織中高于癌旁肝組織;2.肝癌組織中NEK2高表達與肝癌的大小、TNM分期和癌栓呈正相關;3.NEK2高表達是影響肝癌預后的獨立因素。第二部分NEK2對肝癌細胞增殖、凋亡及周期的影響目的研究NEK2對肝癌細胞增殖、凋亡及周期的影響。方法1.Real-time PCR比較NEK2在肝癌細胞株與肝細胞株的表達情況;2.采用 siNEK2 轉染肝癌 HCCLM3 和 Hep-3B 細胞,Real-time PCR 和 Western blot檢測轉染后NEK2 mRNA和蛋白的表達變化;3.siNEK2沉默HCCLM3和Hep-3B細胞中的NEK2表達后,MTS法和單克隆形成實驗檢測肝癌細胞增殖以及流式細胞學技術檢測細胞凋亡和周期的變化。結果在Hep-G2,Hep-3B,HuH-7,SMMC7721,HCCLM3,Snu387和Snu475共7株肝癌細胞株中,Real-time PCR顯示NEK2在mRNA表達水平上均高于肝細胞株Chang liver。采用 siNEK2轉染肝癌HCCLM3和Hep-3B細胞,Real-time PCR和Western blot顯示轉染后的NEK2 mRNA(P0.001)和蛋白均明顯下調。MTS法(P0.05)和單克隆形成實驗(P0.01)顯示siNEK2可以抑制肝癌細胞的增殖。與對照組相比,siNEK2轉染48 h后,流式細胞學技術發(fā)現(xiàn)發(fā)生凋亡的肝癌細胞增加(P0.05),Western blot發(fā)現(xiàn)BAD和C-caspase-3的表達上調,而抗凋亡蛋白BCL-2的表達下調;流式細胞學技術分析HCCLM3和Hep-3B的細胞周期,發(fā)現(xiàn)siNEK2使處于G2/M期的細胞比例減少(P0.05),細胞內CyclinB1和CDK1的蛋白表達水平下降,P27的蛋白表達水平上調。結論1.化學合成的siNEK2能夠有效的下調NEK2在肝癌細胞株HCCLM3和Hep-3B細胞中的表達水平;2.siNEK2后能夠抑制肝癌細胞的增殖能力,促進肝癌細胞凋亡和抑制細胞有絲分裂。第三部分NEK2在維持肝癌腫瘤干細胞自我更新能力和化療藥物耐藥的作用目的研究NEK2在維持肝癌腫瘤干細胞自我更新能力和化療藥物耐藥的作用。方法1.用單克隆形成實驗和細胞微球形成實驗檢測siNEK2對HCCLM3和Hep-3B細胞自我更新能力的影響,CCK-8檢測siNEK2后細胞對化療藥物敏感性的變化;2.Western blot檢測siNEK2后HCCLM3和Hep-3B腫瘤干細胞標記物的變化;3.Real-time PCR 和 Western blot 檢測 siNEK2 后在 HCCLM3 和 Hep-3B 細胞中Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin及其靶基因的變化。結果與轉染對照組相比,單克隆形成實驗顯示siNEK2組腫瘤細胞的單克隆形成能力明顯下降(P0.01),微球形成實驗亦顯示siNEK2組HCCLM3(P0.001)和Hep-3B(P0.01)細胞的微球形成能力明顯低于對照組。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)siNEK2組肝癌細胞對5-Fu和Cisplatin藥物敏感性明顯高于對照組(P0.05)。Western blot顯示腫瘤干細胞標記物Nanog、Sox2和Bmi1的蛋白表達水平,siNEK2組較對照組明顯下降。Western blot在顯示siNEK2后Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin降低的同時,Real-timePCR發(fā)現(xiàn)β-catenin入核調節(jié)腫瘤干細胞的靶基因EpCAM、c-Myc和CD133也明顯下降(P0.01)。Wnt3a是Wnt/β-catenin信號通路的激動劑,在siNEK2組細胞中加入Wnt3a,發(fā)現(xiàn)Wnt3a可以部分恢復因siNEK2受抑制的細胞微球形成能力(P0.01)。結論1.siNEK2后能夠抑制肝癌細胞HCCLM3和Hep-3B的腫瘤干細胞特性,包括微球形成能力和化療藥物耐藥性;2.NEK2對肝癌腫瘤干細胞特性的作用,包括維持自我更新能力和化療藥物的耐藥,可能是通過Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
[Abstract]:The expression of NEK2 mRNA and protein in HCC was significantly higher than that in HCC . The results showed that siNEK2 could inhibit the expression of 尾 - catenin and its target genes in HCCLM3 and Hep3B cells after siNEK2 .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1461152