發(fā)布時間：2018-01-24 20:38

  本文關(guān)鍵詞： 心肌細胞缺氧 自噬 震波治療 AMPK/mTOR　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:盡管近年來針對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)的藥物治療、介入治療(PCI)和外科手術(shù)治療(CABG)取得了很大進展,仍有部分嚴重冠心病患者不能耐受PCI或CABG治療,或已經(jīng)接受以上治療后仍有心絞痛癥狀反復發(fā)作。這類患者僅依賴單純的藥物治療,預后差,死亡率高。體外心臟震波治療是近年來針對嚴重冠心病患者的新的治療手段,目的是改善心肌供血和心臟功能。震波發(fā)揮心臟保護作用的機制尚不甚明確,可能包括促進內(nèi)皮祖細胞的歸巢、刺激血管新生和抑制氧化應激、炎癥和纖維化等。我們前期的細胞實驗和動物實驗均證實震波治療可減輕缺血缺氧所致的心肌細胞凋亡,保護心臟功能。自噬是真核細胞特有的、能夠?qū)毎麅?nèi)的損傷蛋白和細胞器進行降解并重新利用的過程,可實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新,在多種應激和疾病中發(fā)揮重要作用。近年來,越來越多的研究證實自噬參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,但其究竟發(fā)揮正面或是負面作用,仍存在爭議。但有研究發(fā)現(xiàn)輕中度的缺血缺氧誘導的心肌細胞自噬可能是保護性的,而震波治療能否通過影響自噬發(fā)揮心臟保護作用,目前尚無相關(guān)研究數(shù)據(jù)。研究目的:我們利用大鼠心肌細胞系H9c2(1)通過選擇合適的缺氧培養(yǎng)條件,建立心肌細胞體外缺血缺氧模型,探討缺氧時自噬發(fā)生的情況及其作用;(2)選擇作用于缺氧心肌細胞的震波治療所需合適能量;(3)探討震波治療在缺氧損傷中對心肌細胞自噬的影響和其發(fā)揮作用可能的信號通路。研究方法:(1)H9c2細胞在填充有92%N2、5%C02和3%02的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時間后,測定細胞活性和細胞內(nèi)ATP水平以評價細胞損傷的程度;Western blot法檢測LC3B的表達水平,用LC3B-I/II評價自噬發(fā)生的強度。選擇中等強度細胞損傷且自噬發(fā)生較強的缺氧培養(yǎng)時間。(2)缺氧后,分別予細胞相對較低(0.02mJ/mm2)、中(0.05mJ/mm2)和高(0.10mJ/mm2)三種強度的震波治療,測定細胞活力和LC3B表達情況,選擇對細胞活力和自噬強度影響最顯著的震波能量。(3)用MDC法對自噬小泡進行染色,進一步驗證震波治療對缺氧心肌細胞自噬水平的影響;測定震波治療前后細胞內(nèi)ATP水平的變化,探討震波治療對細胞內(nèi)能量代謝的影響。(4)Western blot的方法測定震波治療對自噬相關(guān)主要信號通路蛋白(AMPK、mTOR和Beclin-1等)和細胞存活相關(guān)蛋白(Sirt1和HIF-1α)的表達情況的影響。研究結(jié)果:(1)缺氧處理后,H9c2細胞活力和ATP水平隨著缺氧時間延長逐漸降低,自缺氧6小時開始,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值開始增強,24小時達高峰,此后隨著缺氧時間的延長,該比值逐漸呈下降趨勢。(2)震波治療尤其是相對中等強度的震波(0.05 mJ/mm2)能夠顯著改善缺氧組的細胞活力,且使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高,即缺氧誘導的細胞自噬水平被進一步增強;而對照組的細胞活力在三種強度的震波治療前后均未見明顯變化,較低(0.02 mJ/mm2)或較強(0.10 mJ/mm2)能量的震波均未對自噬水平產(chǎn)生有統(tǒng)計學意義的影響。(3)缺氧24小時后細胞內(nèi)自噬小泡的熒光強度明顯較對照組增強,給予震波治療(0.05mJ/mm2)后熒光進一步增強。檢測震波治療前后細胞內(nèi)ATP水平的變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)震波治療后,缺氧所致的ATP水平下降可較前明顯回升。(4)缺氧后,H9c2細胞內(nèi)磷酸化AMPK、Beclin-1和HIF-1α表達上調(diào),而磷酸化mTOR和Sirt1下調(diào)。震波治療可進一步增強磷酸化AMPK的上調(diào)和磷酸化mTOR的下調(diào),增強Sirt1的表達增加,降低HIF-1α的表達。研究結(jié)論:(1)缺氧培養(yǎng)24小時能夠造成H9c2細胞損傷、功能障礙和死亡;(2)缺氧導致心肌細胞自噬上調(diào),表現(xiàn)為LC3B-II/LC3B-Ⅰ比值增加和細胞內(nèi)自噬小泡數(shù)量明顯增加;(3)能量為0.05mJ/mm2的震波治療能夠進一步提高缺氧誘導的心肌細胞自噬水平,減輕心肌細胞損傷,改善能量代謝,保護心肌細胞功能;(4)震波治療可能通過影響AMPK/mTOR信號通路促進缺氧誘導的心肌細胞自噬,可能通過Sirt1和HIF-1α通路促進細胞存活,發(fā)揮心臟保護作用。
[Abstract]:In recent years , we have studied the effects of shock wave therapy on myocardial cell apoptosis and protecting heart function . ( 4 ) The effects of shock wave therapy on the expression of autophagy - related protein ( AMPK , mtor and Beclin - 1 , etc . ) and cell survival - related proteins ( Sirt1 and HIF - 1偽 ) were measured by Western blot . Results : ( 1 ) After hypoxia treatment , the activity and ATP levels increased gradually with the increase of hypoxia time . ( 4 ) After hypoxia , the expression of phosphorylated AMPK , Beclin - 1 and HIF - 1偽 was regulated .

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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