本文關(guān)鍵詞： 細(xì)胞凋亡 心肌缺血 心肌細(xì)胞 成纖維細(xì)胞 心肌纖維化 絲裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶2 MK2 MMI-0100 細(xì)胞壞死　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景及目的缺血性心臟疾病是目前世界上最常見的致死性疾�。辉诿绹�,每年有約785000個人發(fā)生心肌梗死,幾乎每分鐘一個人。而梗死后心肌的不可逆重塑是導(dǎo)致梗死后心功能不全乃至心衰的主要原因。雖然介入治療-大多數(shù)是早期的再灌注治療-可以增加患者的生存率,但是導(dǎo)致心功能衰竭的心肌不可逆重塑過程卻無法停止。梗死區(qū)域的大小,梗死部位的恢復(fù)以及慢性的左心室重塑決定了最終心力衰竭的程度。為了使梗死后的心力衰竭的程度最小化,在梗死后的早期對梗死區(qū)域進(jìn)行縮小的治療方案顯得尤為重要。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAP激酶,MAPK)鏈?zhǔn)钦婧松镄盘杺鬟f網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一,在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在哺乳動物機(jī)體中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)五種不同的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中ERKl/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞生長和分化,JNK和p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前已知的是,p38MAPK在致死性的心肌梗死過程中與心肌細(xì)胞的死亡,心肌梗死后的心力衰竭、心肌纖維化程度及心肌細(xì)胞的肥大密切相關(guān)；而絲裂原激活的蛋白激酶激活的蛋白激酶2 (MAPKAPK2或者M(jìn)K2),作為p38 MAPK在細(xì)胞內(nèi)的下游絲氨酸／蘇氨酸激酶的底物,也在很多炎性疾病導(dǎo)致的瘢痕形成及纖維化過程中有涉及。近期關(guān)于MK2-/-小鼠的研究證實(shí)了MK2在p38 MAPK通路中的重要作用,并且同時驗(yàn)證了其與p38誘導(dǎo)的心力衰竭密切相關(guān)。此外,MK2-/-小鼠還可以抵抗缺血再灌注的損傷,這些都提示了在缺血性心臟疾病過程中MK2信號通路的重要性。近期的研究報(bào)道了一種細(xì)胞浸透性的短肽MMI-0100在一個小鼠靜脈移植模型中可以抑制術(shù)后炎癥反應(yīng)以及纖維化(內(nèi)膜增生),在一個豬的博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型中可以減輕肺的纖維化程度,在一個腹部手術(shù)模型中可以減輕粘連。因此,我們決定對小鼠急性心肌梗死后通過應(yīng)用MMI-0100抑制MK2信號通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用的假說進(jìn)行實(shí)驗(yàn)�；谙惹暗难芯砍晒�,我們的研究對MMI-0100在小鼠體內(nèi)心肌梗死后降低纖維化范圍的假說進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)。我們證實(shí)了在標(biāo)準(zhǔn)的冠狀動脈左前降支(LAD)結(jié)扎誘導(dǎo)的鼠類心肌梗死模型中MMI-0100在梗死后2周的時間點(diǎn)上降低了心肌纖維化程度。已知MK2信號通路在心肌細(xì)胞死亡、成纖維細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)(其中包括膠原)的分泌(導(dǎo)致纖維化)過程中發(fā)揮重要作用,我們通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MMI-0100在是通過對心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞兩種不同的細(xì)胞分別發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)的心肌保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中,MMI-0100在兩種心肌來源的心肌細(xì)胞(H9C2.HL-1)中可以抑制caspase3/7的活性,而在心肌成纖維細(xì)胞中卻能夠增強(qiáng)caspase3/7的活性。這些研究結(jié)果首次報(bào)告了MMI-0100能夠抑制心肌梗死后的心肌纖維化,同時還闡明了其通過抑制MK2活性進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的凋亡的原理,而且還發(fā)現(xiàn)了其通過對于心肌成纖維細(xì)胞的直接作用達(dá)到減輕心肌纖維化的目的。方法1.動物實(shí)驗(yàn)：(1)我們采用了C57BL/6雄性小鼠的心肌梗死模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn),心肌梗死模型是通過永久性地結(jié)扎冠狀動脈左前降支獲得。我們將小鼠分5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：1.心肌梗死組：永久性結(jié)扎冠狀動脈前降支但無MMI-0100注射；2.心肌梗死后治療組：永久結(jié)扎冠狀動脈前降支后1小時內(nèi),經(jīng)腹膜腔注射MMI-0100,并每日重復(fù)注射14天(50μg/kg/day)；3.假手術(shù)組：假手術(shù)組除了不對冠狀動脈進(jìn)行結(jié)扎外,其他手術(shù)步驟完全相同;4.正常對照組：未行手術(shù)及藥物注射；5.單純藥物注射組：未行手術(shù)但每日重復(fù)注射MMI-0100(50μg/kg/day)14天。期間對小鼠的心功能(LVEDD;LVESD;LV Vol:d；LV Vol;s;FS;EF%等指標(biāo))進(jìn)行測定分析,共分三個測量時間點(diǎn)：基點(diǎn),7天和14天。(2)動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死小鼠,獲取小鼠心臟標(biāo)本并進(jìn)行石蠟包埋,切片,應(yīng)用HE染色及Masson's trichrome (MT)染色進(jìn)行心肌纖維化程度的分析；對組織切片進(jìn)行vimentin, α-SMA, TGF-β1及TUNEL熒光染色以確定組織中不同細(xì)胞組成的改變及對細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行測定。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：(1)原代心肌成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞系的培養(yǎng)我們采用H9C2,HL-1兩種心肌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)方法嚴(yán)格按照已經(jīng)發(fā)表的操作步驟進(jìn)行。(2)缺氧環(huán)境的獲得、缺氧時間點(diǎn)的確定以及細(xì)胞死亡率的確定。缺氧環(huán)境通過將細(xì)胞置入一個缺氧培養(yǎng)箱(使用混合的5%CO2及95%N2提供一個1%氧濃度的缺氧環(huán)境)。每種細(xì)胞分3個實(shí)驗(yàn)組：1)0.5%DMSO終濃度組；2) 20μM MMI-0100[溶于終濃度為0.5%的DMSO]組；3) 100μM MMI-0100[溶于終濃度為0.5%的DMSO]組,并取3個實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)。這些時間點(diǎn)根據(jù)在缺氧環(huán)境中細(xì)胞的LDH釋放量確定的細(xì)胞死亡程度進(jìn)行選擇：H9C2細(xì)胞系：8小時；16小時；24小時；HL-1細(xì)胞系：4小時；8小時；12小時；心肌成纖維細(xì)胞系：16小時；32小時；48小時。(3)細(xì)胞死亡及凋亡的分析使用LDH釋放量測定試劑盒對細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH進(jìn)行測定以確定細(xì)胞的死亡率；使用Caspase3/7活性檢測試劑盒對細(xì)胞裂解液中Caspase3/7的活性進(jìn)行測定以確定細(xì)胞的凋亡率。(4)MK2活性的免疫印跡分析我們采用了hnRNPAO,MAPK2以及phospho-MAPK2三個指標(biāo)來對MK2的活性進(jìn)行分析；(5)細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF α,IL-1β及IL-6細(xì)胞因子的分析。我們對細(xì)胞進(jìn)行處理后的培養(yǎng)基中的TNF α,IL-1β及IL-6等細(xì)胞因子進(jìn)行了定量分析。結(jié)果1.急性心肌梗死后體內(nèi)應(yīng)用MMI-0100短肽治療可保護(hù)心功能并減輕心室擴(kuò)張。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：心肌梗死組的左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)較假手術(shù)對照組減少了26%,左室短軸縮短率(FS%)減少了37%。而MMI-0100治療組則將這兩項(xiàng)指標(biāo)的降低分別減少到了12%和20%。MMI-0100還相應(yīng)地緩解了心梗后典型的左心室容積及其舒張末直徑的增加。而單純MMI-0100治療的對照組顯示其對正常小鼠的心功能和生存率無影響。2.急性心肌梗死后體內(nèi)應(yīng)用MMI-0100治療可以通過減少心肌細(xì)胞的死亡,同時增加成纖維細(xì)胞的死亡來減輕心肌纖維化。(1)動物實(shí)驗(yàn)中,對實(shí)驗(yàn)小鼠的梗死后心肌組織切片進(jìn)行Masson's trichrome染色的結(jié)果證實(shí)急性心肌梗死后接受MMI-0100治療的實(shí)驗(yàn)組心肌纖維化程度較非治療組減少了50%。而且我們在對各組中的有代表性的組織切片進(jìn)行詳盡觀察時還發(fā)現(xiàn),MMI-0100治療組切片在相同層面上的切片中的梗死區(qū)要小,而且在梗死區(qū)內(nèi)部可見到有小的存活的心肌細(xì)胞島。而對組織切片的免疫熒光染色顯示,MMI-0100治療在心梗后可以減少成纖維細(xì)胞的數(shù)量,增加動脈密度并且減少了組織切片中TGF-β陽性的細(xì)胞。這一點(diǎn)證實(shí)MMI-0100可能是通過抑制TGF-β的作用(通過MK2的抑制作用)來實(shí)現(xiàn)其降低非梗死區(qū)心肌纖維化程度,從而發(fā)揮保護(hù)心功能的作用的。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,心肌細(xì)胞來源的H9C2細(xì)胞系及HL-1細(xì)胞系在低氧處理后caspase3/7的活性都有相應(yīng)地增強(qiáng),但在MMI-0100的作用下,這個預(yù)示著細(xì)胞凋亡信號的指標(biāo)卻得到了有效的抑制；而原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,MMI-0100卻顯著增強(qiáng)了caspase3/7的活性。而對細(xì)胞裂解液中蛋白表達(dá)的分析顯示：在H9C2細(xì)胞及HL-1細(xì)胞中,MMI-0100在缺氧處理后明顯抑制了hnRNPAO的表達(dá),然而MK2及p-MK2的表達(dá)水平都沒有明顯的改變;而大鼠心肌成纖維細(xì)胞中,MMI-0100沒有抑制hnRNPAO的表達(dá),MK2及p-MK2的蛋白水平也沒有明顯的改變。而這些研究結(jié)果說明MMI-0100在低氧環(huán)境下能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡,而同時促進(jìn)成纖維細(xì)胞的死亡,這或許能夠說明MMI-0100在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是通過降低了成纖維細(xì)胞的活性從而減輕心肌纖維化程度的。結(jié)論使用合理設(shè)計(jì)的細(xì)胞浸透性短肽MMI-0100通過抑制絲裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶Ⅱ(MK2)的活性能夠在2周后抑制急性心肌梗死后心肌纖維化程度并保護(hù)心臟功能,其機(jī)制牽涉了對心肌細(xì)胞凋亡的抑制,同時還增加了原代心肌成纖維細(xì)胞的死亡。
[Abstract]:Background and Objective Ischemic heart disease is one of the most common fatal diseases in the world . In the United States , there are about 785,000 individuals with myocardial infarction , almost one person per minute . 3 . sham operation group : Except for coronary artery ligation , other surgical procedures were the same ; 4 . Normal control group : no procedure and drug injection ; 5 . Analysis of myocardial fibrosis degree in rats with normal control group : no procedure but repeated injection of MMI - 100 ( 50 渭g / kg / day ) for 14 days . ( 2 ) The cell death and apoptosis were determined by using the serum LDH release assay kit . The results showed that the cell death rate was reduced to 12 % and 20 % . The results showed that the expression of Caspase 3 / 7 in the cells was reduced by 26 % and the decrease of the left ventricular end shortening ( FS % ) was reduced by 37 % . In vivo experiments , the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited in the experimental group , but the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited by the action of MMI - 100 . The mechanism involved the inhibition of myocardial fibrosis and the death of the primary myocardial fibroblasts .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22

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本文編號：1447147