本文關(guān)鍵詞： 雷帕霉素靶蛋白 冬蟲夏草 病毒性心肌炎 心肌成纖維細胞 心肌纖維化　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:病毒性心肌炎(viral myocardifis,VMC)病程遷延可發(fā)展為擴張性心肌病,心肌纖維化是影響病毒性心肌炎預(yù)后的關(guān)鍵因素。研究病毒性心肌炎心肌纖維化的發(fā)生機制,為病毒性心肌炎治療提供理論根據(jù)。冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是中國傳統(tǒng)中藥,可以調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防腎臟纖維化,是否可以抑制心肌纖維化?是我們選用冬蟲夏草作為抑制心肌纖維化藥物的最初設(shè)想。乳類動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一個重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,調(diào)控蛋白質(zhì)的生成,影響細胞生長和細胞周期進程,與細胞生長、增殖密切相關(guān),其靶向抑制劑是雷帕霉素(rapamycin,雷帕霉素),mTOR是否與心肌纖維化相關(guān)?本實驗構(gòu)建心肌成纖維細胞和Balb/c小鼠模型,從細胞水平和動物水平上研究mTOR在病毒性心肌炎心肌纖維化的表達及作用,以及評價冬蟲夏草抗病毒性心肌炎的作用及機制。本實驗分為2個部分:(1)mTOR在病毒性心肌成纖維細胞的表達及冬蟲夏草提取物抗病毒性心肌成纖維細胞增殖的作用研究材料與方法:體外建立柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)感染心肌成纖維細胞模型,分為對照組、CVB3組、雷帕霉素+CVB3組、冬蟲夏草大小不同劑量+CVB3組、冬蟲夏草+雷帕霉素+CVB3組,應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素和冬蟲夏草干預(yù)CVB3感染大鼠心肌成纖維細胞,通過MTT法檢測細胞增殖活力,RT-PCR檢測CVB3-m RNA、mTOR-m RNA、TGF-β1 m RNA、膠原I-m RNA、膠原III-m RNA,western印跡檢測mTOR和mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1、以及TGF-β1、Smad蛋白和膠原-I。結(jié)果:1)CVB3可以感染心肌成纖維細胞,發(fā)生細胞病變。2)RT-PCR,qRT-PCR檢測心肌成纖維細胞mTOR/β-actin光密度值,CVB3組高于對照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。Western Blot檢測mTOR蛋白以及下游蛋白P-P70S6K、P-4EBP1,CVB3組P-P70S6K高于對照組,CVB3+雷帕霉素組P-P70S6K低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);CVB3組P-4EBP1低于對照組,CVB3+雷帕霉素組P-4EBP1高于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。3)RT-PCR,qRT-PCR檢測心肌成纖維細胞I型膠原光密度值,CVB3組高于對照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);Western Blot檢測I型膠原灰度值。CVB3組高于對照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);4)RT-PCR檢測心肌成纖維細胞TGF-β1光密度值,Western Blot檢測TGF-β1和Smad3灰度值,CVB3組高于對照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。(5)RT-PCR檢測心肌成纖維細胞細胞CVB3 m RNA光密度值:CVB3組可以檢測到CVB3 m RNA表達,冬蟲夏草組低于CVB3組,差異具有顯著性(P0.05)。6)冬蟲夏草提取物和蟲草素干預(yù)CVB3心肌成纖維細胞,心肌成纖維細胞CVB3、mTOR、TGF-β1、膠原-I和膠原m RNA表達較CVB3組均降低,mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K較CVB3組降低、P-4EBP1較CVB3組升高、TGF-β1、Smad蛋白和膠原-I和膠原 III較CVB3組均降低,差異均具有顯著性(P0.05)。上述作用具有劑量依賴性,大劑量冬蟲夏草效果更明顯。(2)MTOR在病毒性心肌炎慢性期小鼠的表達及冬蟲夏草抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纖維化的作用研究材料與方法:通過采用CVB3(先后2次從腹腔注射病毒的經(jīng)典方法制造)病毒性心肌炎小鼠慢性期模型。分為正常對照組、模型組、冬蟲夏草大小劑量組以及卡托普利對照組,通過統(tǒng)計死亡率;實驗60天結(jié)束時檢測心肌膠原容積分?jǐn)?shù)CVF(MASSON染色),RT-PCR檢測心肌mTOR m RNA,western印跡檢測mTOR、及mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1,以及TGF、Smad蛋白和心肌組織中膠原-I。結(jié)果:1)CVB3病毒性心肌炎小鼠慢性期動物模型建立成功。2)統(tǒng)計各組小鼠死亡率,模型組小鼠死亡數(shù)目最多,冬蟲夏草大劑量組小鼠死亡數(shù)目最少,空白對照組沒有死亡,差異具有顯著性(P0.05)。3)心肌病理顯示模型組小鼠心肌纖維化較對照組明顯,冬蟲夏草組小鼠纖維化較模型組減輕,存在量效依賴性。4)心肌組織mTOR m RNA及下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1表達:病毒組mTOR m RNA及下游標(biāo)志物P-P70S6K較正常對照組明顯升高,P-4EBP1降低,差異有顯著性(P0.01)�？ㄍ衅绽M和冬蟲夏草大劑量組,與病毒模型組相比較MTOR m RNA、P-P70S6K表達明顯降低,P-4EBP1表達升高,差異有顯著性(P0.01);而冬蟲夏草大劑量組和小劑量組mTOR m RNA水平相比,劑量依賴性,差異有顯著性(P0.01)。5)心肌組織TGF-β1 m RNA、Smads蛋白表達:病毒模型組的TGF-β1m RNA、Smads蛋白與正常對照組明顯升高,差異有顯著性(P0.01)�？ㄍ衅绽M和冬蟲夏草大、小劑量組較病毒模型組明顯降低,差異有顯著性(P0.05),而冬蟲夏草大劑量組和小劑量組mTOR m RNA水平相比,劑量依賴性,差異有顯著性(P0.01)。6)心肌組織膠原-1和膠原-3的表達。病毒模型組膠原-1和膠原-3的表達較對照組均明顯增高,差異有顯著性(P0.01)�？ㄍ衅绽M和冬蟲夏草大、小劑量組與病毒模型組相比膠原-1表達明顯降低(P0.05);且冬蟲夏草大劑量組膠原-1表達量與冬蟲夏草小劑量組相比有下降,差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論:1)心肌成纖維細胞可作為CVB3感染的VMC細胞模型。2)CVB3病毒性心肌炎慢性期小鼠模型可以作為研究VCM心肌纖維化動物模型。3)mTOR信號通路活化是CVB3誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞增殖機制之一,雷帕霉素是mTOR作用的靶點。4)從細胞和動物水平顯示mTOR信號通路參與VCM心肌纖維化,并且可能與TGF-β1、Smad信號通路相互作用。5)冬蟲夏草具有抗CVB3作用,具有抑制CVB3心肌成纖維細胞增殖的作用,具有抗VMC小鼠心肌纖維化、降低VMC小鼠死亡率作用,上述作用具有量效依賴性,大劑量效果更明顯,其機制之一可能是通過抑制mTOR信號通路,并可能和TGF-β1、Smad信號通路相互作用抑制心肌纖維化。因此,本研究從體外CVB3心肌成纖維細胞模型和體內(nèi)CVB3病毒性心肌炎小鼠模型實驗表明,mTOR通路參與心肌成纖維細胞增殖和病毒性心肌炎心肌纖維化,冬蟲夏草具有抗VMC纖維化作用,且有劑量依賴性,其作用機制之一抑制mTOR通路,并可能和TGF-β、Smads通路相互作用,共同參與心肌纖維化。以往的研究表明,VMC心肌纖維化實際是多個因素參與的復(fù)雜的生物過程。本研究結(jié)果從另一個方面提示,雷帕霉素、冬蟲夏草具有抑制mTOR通路參與抗心肌纖維化作用,為尋找治療VMC心肌纖維化藥物提供理論依據(jù)和新思路。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of myocardial fibrosis induced by viral myocarditis ( CVB3 ) . The expression of TGF - 尾1 , P - 4EBP1 , CVB3 and CVB3 in CVB3 group were higher than those in the control group , and the difference was significant ( P0.05 ) . T-PCR媯，

本文編號：1446862