本文關(guān)鍵詞：野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠右室心肌細胞自噬及調(diào)控機制的研究　出處：《廣西醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肺動脈高壓(Pulmonary artery hypertension,PAH)是一種進行性的肺血管與心臟結(jié)構(gòu)功能異常的病理生理綜合征。盡管肺血管損害是PAH原發(fā)病變,然而患者的臨床預(yù)后主要取決于右心室的功能狀態(tài)。目前,臨床上PAH的藥物主要為抑制肺血管平滑肌細胞增殖與肺血管收縮,此類藥物能降低肺動脈壓、緩解PAH患者的癥狀與改善生活質(zhì)量,但并不能有效逆轉(zhuǎn)患者右心室功能狀態(tài)與臨床預(yù)后。臨床上對右心室重構(gòu)機制及藥物治療的認識均源于左心室。遺憾的是,PAH右心室重構(gòu)可能存在與壓力負荷左心室并不完全相同的機制,因此大部分治療左心衰的藥物對右心衰并無效果。深入研究PAH右室重構(gòu)的細胞和分子機制為PAH治療藥物篩選,開發(fā)右室特異性藥物、逆轉(zhuǎn)右室重構(gòu),從而改善患者預(yù)后具有重要的科學意義及臨床價值。自噬是一種酵母至哺乳動物進化過程中形成的,通過細胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹細胞成份,并與溶酶體相溶合、從而形成自噬溶酶體,籍此降解與再循環(huán)長壽命蛋白與細胞器的生命活動過程。目前證實,自噬與細胞存亡調(diào)控存在密切關(guān)系,參與了多種結(jié)構(gòu)性心臟病心臟重構(gòu)。右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)重要的病理生理基礎(chǔ)。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)與缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,Hif1-α)/腺病毒E1B 19 k Da蛋白相互作用蛋白3(Adenovirus E1B 19-k Da interacting protein 3,BNIP3)/Beclin-1是缺氧條件下細胞自噬激活的兩條重要信號通路。但PAH右室重構(gòu)過程中右室心肌細胞自噬時序性變化?以上兩條信號通路是否參與PAH右室心肌自噬調(diào)控?不同信號通路激活自噬對心肌細胞的作用如何?尚未闡明。本課題在建立野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導PAH大鼠模型及缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細胞模型的基礎(chǔ)上,通過以下三部分的實驗,初步探討PAH右心室重構(gòu)發(fā)展過程中心肌自噬變化規(guī)律、可能調(diào)控機制及其生物學作用。該研究結(jié)果將為PAH治療藥物篩選,開發(fā)右室特異性自噬調(diào)控藥物、防治PAH右室重構(gòu)與功能異常提供初步理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。第一部分野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠模型建立及右室心肌缺氧相關(guān)指標變化。目的:建立野百合堿誘導PAH大鼠模型,觀察PAH大鼠右室結(jié)構(gòu)、功能變化;并探討PAH大鼠右室心肌細胞缺氧相關(guān)指標變化。方法:60只8周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機分為MCT組(n=36)及對照組(n=24)。兩組動物均設(shè)2、4、6周3個時點亞組;MCT組每個時點亞組12只,對照組每個時點亞組8只。采用經(jīng)項背部皮下注射MCT(60mg/kg)建立肺動脈高壓模型(MCT組),對照組(CON組)注射等量生理鹽水。實驗終點對存活大鼠行超聲心動圖檢查,測量右室結(jié)構(gòu)與功能參數(shù);右心導管檢測肺動脈收縮壓(Pulmonary artery systolic pressure,PASP)、肺動脈平均壓(Pulmonary artery mean pressure,PAMP);測量右室肥厚指數(shù);蘇木精—伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色了解肺血管及右室心肌組織病理改變,測量肺血管阻塞率,心肌細胞直徑,Masson染色檢測心肌膠原含量。麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin staining,WGA)檢測右室心肌細胞面積大小;CD31免疫熒光染色檢測心肌毛細血管生成;用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、免疫組化與蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測心肌肌紅蛋白(myoglobin)的m RNA與蛋白表達。結(jié)果:與對照組相比,MCT大鼠PASP、PAMP均顯著增高,以6周組為著。MCT大鼠2周時右室心肌輕度肥厚、右室收縮功能維持正常;4周右室擴大,心室明顯肥厚、收縮功能輕度減低;6周時右室顯著擴大重構(gòu)、心功能顯著降低并出現(xiàn)右心衰癥狀。組織病理學上,MCT大鼠肺動脈血管阻塞率較對照組增高并持續(xù)增加;2周始右室心肌細胞直徑及面積輕度增大,4周與6周最為顯著。MCT大鼠2周亞組右室心肌膠原含量與對照組無顯著差異,而4與6周亞組MCT顯著增多。與對照組相比,MCT大鼠的2周亞組心肌毛細血管數(shù)目、myoglobin的m RNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義,而4周與6周亞組則顯著降低。結(jié)論:MCT成功構(gòu)建PAH大鼠模型,復制PAH右室重構(gòu)的發(fā)展過程。MCT大鼠2周出現(xiàn)右室心肌細胞肥大;而4周及6周時心肌細胞持續(xù)增大、毛細血管減少與心肌myoglobin水平降低誘導右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)的重要病理生理基礎(chǔ)。第二部分肺動脈高壓大鼠右室心肌細胞自噬變化及可能的調(diào)控通路目的:探討PAH大鼠右室重構(gòu)過程中,右室心肌細胞自噬時序性變化規(guī)律及其與肺動脈收縮壓的關(guān)系;闡明缺氧相關(guān)自噬信號通路在PAH大鼠右室心肌自噬的調(diào)控作用。方法:動物造模與分組同第一部分。RT-q PCR檢測右室與左室心肌自噬標志蛋白-微管相關(guān)輕鏈蛋白3(Microtubule associated light chain protein 3,LC3)m RNA水平;免疫組化及Western blot檢測LC3蛋白表達;western blot檢測自噬體降解標志蛋白P62表達;透射電鏡觀察右室心肌細胞自噬體形態(tài)與數(shù)目。Western blot檢測右室心肌AMPK/m TOR及Hif-1α/BNIP3/Beclin-1缺氧通路的關(guān)鍵蛋白p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,p-p70S6K,p70S6K以及Hif-1α,BNIP3,Beclin-1,Bcl2的表達水平。結(jié)果:與對照組相比,MCT大鼠右室心肌LC3,LC3-II/LC3-I比值及于2,4,6周持續(xù)上調(diào)表達,而P62則下調(diào)表達;透射電鏡顯示右室心肌細胞內(nèi)自噬體持續(xù)增多;相反,對照組各時點亞組LC3,LC3-II/LC3-I比及P62差異無統(tǒng)計學意義,心肌細胞內(nèi)自噬體少見。此外,MCT及對照組大鼠的各時點亞組左室心肌LC3,LC3-II/LC3-I及P62差異均無統(tǒng)計學意義。右室心肌LC3蛋白水平與增高的肺動脈收縮壓呈顯著正相關(guān)(r2=0.626,P0.01)。與對照組相比,p-AMPK蛋白于2周至4周上調(diào)表達,而在6周時下調(diào)表達;相反,p-m TOR則表現(xiàn)為2周至4周下調(diào),而在6周時上調(diào)表達;各時點AMPK,m TOR及p70S6K蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。然而,與對照組相比,BNIP3、Beclin-1蛋白于2周至4周呈較低水平表達,而6周時顯著上調(diào),Hif-1α與BNIP3變化趨勢不完全一致,于4周達峰值,6周稍下降。此外,MCT大鼠右室心肌Bcl2于2周時達到峰值,4周至6周依次降低。對照組各時點亞組右室心肌相關(guān)蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:PAH右室心肌持續(xù)激活自噬與增高的肺動脈收縮壓呈顯著正相關(guān)關(guān)系。AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1缺氧相關(guān)自噬信號通路可能參與了PAH右室自噬調(diào)控;2周至4周自噬激活主要通過AMPK/m TOR通路,而6周時則主要為BNIP3/Beclin-1通路依賴,BNIP3的活化不完全受Hif-1α所調(diào)控。第三部分AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1通路調(diào)控自噬對缺氧心肌細胞的影響目的:通過研究AMPK/m TOR和BNIP3/Beclin-1調(diào)控自噬對缺氧心肌細胞影響;結(jié)合第二部分研究,進一步揭示不同通路激活自噬對PAH右室重構(gòu)的作用。方法:(1)將一組大鼠心肌細胞株H9C2細胞分為常氧組、缺氧組(2天)、缺氧+AMPK抑制劑(Compound C)組、缺氧+AMPK激活劑(AICAR)組共四亞組;western blot檢測心肌細胞p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR通路關(guān)鍵蛋白表達;單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)熒光染色觀察心肌自噬體,western blot檢測LC3蛋白表達水平;在bafilomycin A1處理缺氧及缺氧+AICAR心肌細胞的基礎(chǔ)上,再次通過MDC熒光染色觀察自噬體,western blot檢測LC3蛋白表達水平;WGA熒光染色顯示心肌細胞大小,RT-q PCR檢測心房鈉尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)與B型腦鈉肽(Type B natriuretic peptide,BNP)的m RNA表達;CCK8法檢測心肌細胞存活率;流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡。將另一組心肌細胞分為缺氧組、缺氧+AICAR組、缺氧+AICAR+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體,Western blot檢測LC3蛋白表達水平;CCK8法檢測心肌細胞存活率;流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡。(2)將一組心肌細胞分為常氧組、缺氧組(4天)、陰性對照組,缺氧+BNIP3-RNAi干擾組,缺氧+LV-BNIP3過表達共五亞組;Western blot檢測心肌細胞BNIP3及Beclin-1通路關(guān)鍵蛋白表達水平;MDC熒光染色檢測心肌細胞自噬小體,Western blot檢測LC3蛋白表達水平;CCK8法檢測心肌細胞存活率;流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡。在bafilomycin A1處理缺氧及缺氧+LV-BNIP3過表達心肌細胞的基礎(chǔ)上,再次通過MDC熒光染色觀察自噬體,western blot檢測LC3蛋白表達水平。將另一組心肌細胞分為缺氧組、缺氧+陰性對照組、缺氧+LV-BNIP3過表達組、缺氧+BNIP3過表達+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體,Western blot檢測LC3蛋白表達水平;CCK8法檢測心肌細胞存活率;流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡。結(jié)果:(1)與常氧組相比,缺氧組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達,而p-m TOR/m TOR下調(diào)表達;MDC熒光強度增高,LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達;心肌細胞存活率下降,而凋亡率增高。與缺氧組相比,Compound C干預(yù)組p-AMPK/AMPK下調(diào)表達,而p-m TOR/m TOR上調(diào)表達;MDC熒光強度降低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達;心肌細胞存活率降低;凋亡率顯著增高。相反,AICAR干預(yù)組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達,而p-m TOR/m TOR下調(diào);MDC熒光強度增強,LC3-II/LC3-I比值增高;心肌細胞存活率增高;凋亡率顯著降低。各組心肌細胞大小及ANP、BNP m RNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后,缺氧及缺氧+AICAR干預(yù)組心肌細胞MDC熒光強度及LC3-II/LC3-I顯著增加。與缺氧+AICAR組相比,缺氧+AICAR+3-MA組心肌細胞MDC熒光強度降低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達;心肌細胞存活率降低;凋亡率顯著增高。(2)與常氧組相比,缺氧組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達;MDC熒光強度增強,LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達,心肌細胞存活率下降,凋亡率增加。與缺氧組相比,BNIP3-RNAi干擾組的BNIP3及Beclin-1下調(diào)表達,MDC熒光強度減低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達;心肌細胞存活率增加,凋亡率降低;相反,LV-BNIP3過表達組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達,MDC熒光強度增強,LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達;心肌細胞存活率降低,凋亡率增高。陰性對照組與缺氧培養(yǎng)組各檢測指標差異無統(tǒng)計學意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后,缺氧及缺氧+LV-BNIP3過表達組心肌細胞MDC熒光強度及LC3-II/LC3-I顯著增加。與未經(jīng)3-MA處理缺氧+LV-BNIP3過表達組相比,經(jīng)3-MA處理的缺氧+LV-BNIP3過表達心肌細胞MDC熒光強度減低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達;心肌細胞存活率增加;而凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:缺氧條件下,AMPK/m TOR通路通過自噬激活發(fā)揮促心肌細胞存活(包括凋亡抑制),而對心肌細胞大小無顯著影響;BNIP3/Beclin-1通路通過調(diào)控自噬水平促進心肌細胞死亡。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

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本文編號：1330291